截斷法與逆挽法治療慢加急性肝衰竭的網絡藥理學研究*

迪力甫沙·地力木拉提 馬重陽 張秋云

首都醫科大學中醫藥學院中醫絡病研究北京市重點實驗室 (北京， 100069)

錢英教授是全國老中醫藥專家學術經驗繼承指導教師，全國名中醫，首都國醫名師。錢老結合臨床經驗擬定截斷逆挽方治療慢加急性肝衰竭(ACLF)的療效已被多項實驗與臨床研究證實[1-3]。截斷逆挽方中融合的治法為截斷法(清熱解毒、涼血化瘀)和逆挽法(健脾益氣、滋補肝腎)，由葉下珠、瓜蔞、金錢草、生黃芪、槲寄生、三七、莪術、丹參、生地黃、黑附片10味藥組成，對應了ACLF本虛標實的基本病機，是臨床治療該病的代表方[4]。本研究利用網絡藥理學的方法，分別比較截斷逆挽方中截斷法和逆挽法藥物的活性成分與靶點信息，探討截斷法和逆挽法在ACLF治療中的潛在生物學內涵。

1 資料與方法

1.1 截斷逆挽方活性成分的收集與篩選 本研究利用TCMSP平臺并檢索pubmed數據庫收集截斷逆挽方的所有成分，設置藥物成分的OB↑≥30%，DL↑≥0.1，CACO-2↑≥0作為條件篩選截斷逆挽方的活性成分。

1.2 截斷逆挽方活性成分作用靶點的收集 利用TCMSP數據庫獲取截斷逆挽方中篩選出的每個活性成分對應的潛在靶點信息，并將不同來源的靶標在UniProt(http://www.uniprot.org)數據庫中檢索，得到所有靶點的基因名，用于后續網絡藥理學分析。

1.3 截斷逆挽方活性成分-靶點相互作用網絡的構建 研究將截斷逆挽方中10味藥分截斷組和逆挽組展開研究，其中截斷組藥物有清熱解毒、涼血化瘀的功效，包含葉下珠、瓜蔞、金錢草、莪術、丹參、三七、生地7味藥；逆挽組藥物有健脾益氣、滋補肝腎的功效，包括生黃芪、槲寄生、黑附子3味藥。利用Cytoscape 3.6軟件構建截斷逆挽方活性成分-靶點相互作用網絡，并對活性成分進行分類注釋，分為截斷組成分、逆挽組成分和兩組共有成分3個類型。

1.4 截斷逆挽方靶點參與生物學過程的富集分析 用DAVID數據庫對上述相互作用網絡中靶點進行生物學過程的富集分析，初步得到截斷逆挽方全方抗ACLF的作用特點。

1.5 截斷法和逆挽法靶點蛋白質-蛋白質相互作用網絡的構建 利用String數據庫，對截斷逆挽方中截斷組藥物活性成分對應靶點和逆挽組藥物活性成分對應靶點分別進行蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)分析，分別構建兩個PPI網絡。利用Cytoscape3.6插件Network Analyzer計算節點度，評價靶點在網絡中的重要性。

1.6 截斷法和逆挽法靶點KEGG信號通路富集分析 利用DAVID數據庫，對截斷逆挽方中截斷組藥物活性成分對應靶點和逆挽組藥物活性成分對應靶點分別進行KEGG信號通路分析，比較兩組富集到的生物信號異同。

2 結果

2.1 截斷逆挽方的活性成分與靶點相互作用網絡 研究經TCMSP數據庫及文本檢索后進行OB值和DL值篩選，得到了截斷逆挽方的藥物活性成分，其中葉下珠8個，瓜蔞14個，金錢草8個，莪術3個，丹參67個，三七9個，生地黃3個，生黃芪24個，槲寄生7個，黑附子17個。去除重復成分后，截斷組藥物共有88個活性成分，逆挽組藥物共有32個活性成分，兩組之間存在6個共有成分。利用Cytoscape軟件構建截斷逆挽方活性成分-靶點相互作用網絡，該網絡包含254個節點，2 191條邊(見圖1)。網絡中可觀察到有76個活性成分作用在PTGS2靶點上，69個活性成分作用在NOS2靶點上，61個活性成分作用在GSK1B靶點上，這些活性成分在截斷組和逆挽組均有分布，表明截斷組藥物成分和逆挽組藥物成分在不同靶點上均具有一定的協同作用。

圖1 截斷逆挽方成分-靶點相互作用網絡

2.2 截斷逆挽方靶點參與的生物學過程富集 研究利用DAVID數據庫對截斷逆挽方相關靶點進行生物學過程的富集分析，發現截斷逆挽方可能參與了多條與ACLF相關的生物學過程，以P值排序，排名前10 的生物學過程分別是對缺氧的反應、正調控細胞增殖、對有毒物質的反應、誘導MAPK活性、血小板激活、細胞增殖、細胞對脂多糖的反應、負調控凋亡過程、正調控活性氧的代謝過程等(表1)。

表1 截斷逆挽方靶點參與的生物學過程

2.3 截斷逆挽方靶點蛋白質-蛋白質相互作用網絡 利用String數據庫，我們對截斷法和逆挽法的藥物相關靶點進行PPI分析及網絡構建，分別得到了包含145個節點，1 484條邊和129個節點，1 240條邊的PPI網絡。拓撲分析以Degree值排序，截斷法與逆挽法藥物PPI網絡中排名前5的靶點均為IL6(67/63)、VEGFA(62/58)、TP53(59/56)、TNF(58/56)、MAPK1(57/55)。此外研究發現，同一靶點在兩個PPI網絡中的重要性也有不同，如在PPI網絡中BCL2排序兩者相差30，THBD排序則相差21，TOP2A排序相差17。

2.4 截斷法、逆挽法藥物靶點KEGG信號通路分析 利用DAVID數據庫對截斷法藥物靶點和逆挽法藥物靶點分別進行KEGG信號通路分析，以探討這些藥物的潛在生物學內涵。結果顯示截斷法、逆挽法的靶點可在相同的KEGG信號通路中顯著富集，這些信號通路可能是截斷逆挽方抗ACLF的藥理機制(表2)。這些信號包括神經活性配體-受體相互作用、TNF信號通路(TNF)、HIF-1信號通路(HIF-1)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt)、縫隙連接、乙型肝炎、雌激素信號通路、T細胞受體信號通路、甲狀腺激素信號通路、NOD樣受體信號通路、VEGF信號通路、神經營養因子信號通路、細胞色素P450對異生素的代謝、丙型肝炎、Toll樣受體信號通路、細胞周期、MAPK信號通路、NF-κB信號通路、B細胞受體信號通路。此外，我們還發現一些不重合的信號，如截斷法藥物與P53信號通路相關，逆挽法藥物與PPAR信號通路相關。

表2 截斷法、逆挽法藥物靶點共同參與的KEGG信號通路

3 討論

2019年《慢加急性肝衰竭中醫臨床指南》提出截斷逆挽法是搶救肝衰竭成功的關鍵治法。截斷法包括清熱解毒、涼血化瘀、通腑等，逆挽法包括滋肝、健脾、溫陽、補腎等。錢英教授將截斷法和逆挽法相結合創制截斷逆挽方治療慢性重型肝炎，療效較好[3]。本團隊在基礎研究中發現，截斷逆挽方能夠降低慢加急性肝衰竭大鼠的死亡率、血清轉氨酶水平，抑制血清炎癥因子水平、細胞凋亡并促進細胞代償性增殖[5-9]，其具體藥理機制可能涉及E2F1、JNK及線粒體凋亡等多個信號。

本研究發現截斷逆挽方中截斷法和逆挽法藥物有6個活性成分的重合，共對應118個靶點，占全方活性成分對應靶點的77.63%，表明從活性成分的角度解讀截斷法和逆挽法并非絕對保守。同時，全方成分在不同的靶點上具有協同作用， PTGS2、NOS2、NOS3均與氧化應激有關。臨床研究顯示，ACLF患者會出現系統性的氧化應激反應，這種現象可被檢測循環中白蛋白的氧化還原狀態所證實[10]。因此我們認為截斷逆挽方可能具有抗氧化的藥理活性。有學者提出“三重打擊學說”闡釋肝衰竭的發病機制，即肝組織在肝衰竭發生過程中依次經受了免疫損傷、缺血缺氧和內毒素血癥等三重打擊[11]。本研究顯示截斷逆挽方可正調控活性氧的代謝過程，對缺氧的反應、正調控細胞增殖、對有毒物質的反應、負調控凋亡過程、炎癥反應等生物學過程也有顯著富集，說明截斷逆挽方在對抗肝衰竭的三重打擊中均具有一定的藥理活性。值得注意的是，有研究認為ACLF從發病到進展成肝衰竭之間有過渡時間窗，此階段以免疫應答過激為主要免疫學特點，若給予積極有效的干預，部分患者病情可得到逆轉[10]，這與錢英教授提出的截斷法不謀而合。實際上，免疫細胞和細胞因子參與了ACLF的全過程，早期處于免疫過度激活狀態，造成肝組織免疫性損傷，并形成系統性炎癥反應綜合征，隨后又處于抑制狀態，增加感染風險，甚至出現膿毒血癥。因此，未來對于截斷逆挽方抗ACLF藥理作用的研究可圍繞免疫相關靶點展開。

本研究利用String數據庫對截斷法、逆挽法藥物靶點蛋白形成的PPI網絡進行研究，發現IL6、VEGFA、TP53、TNF、MAPK1等靶點在兩個PPI網絡中具有相近的拓撲排序，表明截斷法和逆挽法在某些方面具有協同作用。VEFGA與肝再生相關，IL6、TNF及MAPK1是炎癥反應的重要活性分子，TP53與肝細胞凋亡相關，均具有抗ACLF的潛在作用。而BCL2、THBD和TOP2A在兩個PPI中重要程度有所差異，可能是理解截斷法和逆挽法各自特點的關鍵靶點。KEGG信號通路富集分析發現截斷法和逆挽法在多條信號通路上具有協同作用，與免疫反應相關，包括TNF信號通路、T細胞受體信號通路、NOD樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路、MAPK信號通路、NF-κB信號通路、B細胞受體信號通路等。對這些信號通路的調控能夠顯著影響肝衰竭的病情進展和病理進程，是治療ACLF的潛在治療靶點[12-15]。此外，截斷法、逆挽法藥物重合的信號通路還包括PI3K-Akt信號通路和細胞周期，前者能夠抑制肝細胞凋亡，后者與肝細胞增殖有關[16,17]。神經活性配體-受體相互作用及神經營養因子信號通路等神經系統相關信號也被識別，對這些信號的調控可能改善ACLF相關的肝性腦病，保障大腦功能發揮正常。我們還發現了截斷法藥物的特有信號P53信號通路及逆挽法藥物的特有信號PPAR信號通路；截斷法中的17個藥物活性成分可與PPAR受體相互作用(γ型和δ型)，文獻支持截斷法藥物中的活性成分如槲皮素、常春藤皂甙元與PPAR-α、γ、δ型均存在一定程度的相互作用，活性成分異鼠李亭可與PPAR-α、γ型相互作用[18-21]。因此，截斷法藥物可能通過P53信號通路發揮抗凋亡作用，逆挽法可能具有多靶點作用于PPAR信號通路的作用，發揮維持脂質代謝功能、調節氧化應激和炎癥反應的作用。

本研究還發現大部分截斷逆挽方的化學成分口服利用度較低，因此中藥復方存在與腸道菌群相互作用的可能，通過調節腸道菌群發揮抗ACLF的藥理作用。這些均是本網絡藥理學研究的局限，需要未來的實驗研究深入探討。