軟肝顆粒抑制血管新生的抗肝纖維化作用機制研究*

鐘培玲 陳英杰 柳 臻 朱倩欣 賀勁松△

1.廣州中醫藥大學第四臨床醫學院2018級碩士研究生班 (廣東 深圳， 518033) 2.廣州中醫藥大學第四臨床醫學院2017級碩士研究生班 3.深圳市中醫院肝病科

肝纖維化是指各種原因引起肝臟慢性損傷后的一種修復應答，是多種慢性肝臟疾病的共同病理過程，也是發展為肝硬化的必經階段。細胞外基質過度沉積及肝星狀細胞(HSC)的活化是其主要發病機制。血管新生是肝纖維化發展過程中的重要病理過程，被認為是肝纖維化的前奏[1，2]。已有研究表明，抑制血管新生能有效抑制纖維化的形成[3]。血管新生成為肝纖維化形成與逆轉的關鍵環節。軟肝顆粒是我科治療肝纖維化、肝硬化的有效中藥復方，既往研究發現，軟肝顆粒聯合恩替卡韋可以進一步提高肝臟纖維化逆轉率[4]。可能通過以下機制發揮抗肝纖維化作用[5,6]：①下調PBMC中TGF-β1mRNA和上調IFN-γ和IL-8 mRNA表達；②抑制AngⅡ誘導HSC上調基因的表達。但沒有從血管新生的角度對軟肝顆粒抗肝纖維化進行相關研究,本研究探討軟肝顆粒抑制血管新生的抗肝纖維化機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取 2016年9月至2017年8月我院乙型肝炎進展性肝纖維化患者90例，其中男68例，女22例，年齡19～64歲，平均(39.62±9.61)歲。按2∶1比例隨機分為治療組和對照組。使用交互性語音應答系統(IVRS)進行隨機化管理。研究者通過電話與IVRS系統聯系，輸入相關數據，系統將自動進行隨機化。治療組60例(男45例，女15例)，平均年齡(39.10±10.27)歲；BMI均值為(21.61±1.50)kg/m2。對照組30例(男23例，女7例)，平均年齡(40.67±8.21)歲；BMI均值為(21.73±1.57)kg/m2。兩組患者在一般資料方面均衡可比。患者入組時，一般情況以及肝臟硬度值(LSM)、肝脾超聲積分、脾臟厚度方面比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標準 現代醫學診斷標準參考2015年版《慢性乙型肝炎防治指南》中標準[7]：①血清HBsAg陽性，HBV DNA定量≥2 000 IU/ml，HBeAg陽性或陰性；②ALT>50 U/L；③組織學、影像學、生化學或血液學檢查提示有門靜脈高壓癥或肝細胞合成功能障礙的證據，無腹水、食管胃底靜脈曲張破裂出血或肝性腦病等。中醫學診斷標準參考2010年版《肝纖維化中西醫結合診療指南》中的中醫證型診斷標準[8]，符合氣虛血瘀夾濕熱證。主癥：①神疲乏力，面色晦暗；②肝區不適或脹或痛，痛處固定；③口干口苦或口臭；④舌質暗或有瘀斑、瘀點，苔黃膩；次癥：①脅痛入夜尤甚；②大便黏膩臭穢或干結；③納呆，胃脘脹悶；④病程較長，久痛不已； ⑤脈弦數。凡具備主癥 2項、次癥1項或主癥1項、次癥3項者均屬本證。

1.3 納入排除標準 納入標準：①符合上述訴診斷標準；②18歲≤年齡≤65歲；③肝組織病理學≥S3，或肝脾超聲積分>8分，或FibroScan肝臟硬度值>12.4 kPa；④患者簽署知情同意書后，自愿參加本研究。排除標準：①HBsAg陰性；②Child-Pugh積分≥7分；③同時感染HIV、HCV、HDV者；④合并代謝性或自身免疫性肝病者；⑤肝癌患者；⑥精神病和其他嚴重臟器疾病者；⑦懷孕或哺乳期婦女；⑧有濫用酒精或非法藥品史者，30天內參加其他肝炎藥物的試驗者；⑨不能夠或者不愿意簽署知情同意書或不遵守研究規定者；⑩對試驗藥物過敏者。

1.4 治療方法 對照組患者口服恩替卡韋(百美施貴寶公司生產，0.5 mg/片)0.5 mg/次，1次/d。治療組患者在此基礎上加用軟肝顆粒，方由葉下珠、黃芪、生地黃、當歸、五味子、丹參、桃仁、三七、穿山甲(炮)、鱉甲(制)、枳殼、茯苓組成。由具有GMP認證的深圳三九制藥廠按中藥顆粒劑制備，規格20 g/袋，1袋/次，溫開水沖至150 ml，飯后服用，2次/d。兩組患者療程均為96周。

1.5 觀察指標及檢測方法

1.5.1 肝組織病理學檢查 在彩色超聲引導下行經皮肝臟穿刺活檢。肝穿刺標本長度超過1 cm，至少包括6個以上肝小葉范圍。肝組織標本用甲醛固定后，送深圳市中醫院病理科，行石蠟包埋，連續切片，常規做蘇木精-伊紅、Masson三色染色和(或)網狀纖維染色，由2名資深病理醫師單獨閱片，進行Knodell、Ishak評分[9,10]，在治療前及治療96周時各行肝穿刺1次。對比前后評分變化。

1.5.2 Fibroscan測定肝臟硬度值(LSM) 將Fibroscan儀器(法國Echosens公司產品)M型探頭(3.5 MHz)置于患者右腋前線至右腋中線第7、8肋間或第8、9肋間，連續測量彈性數值10次，取中位數作為LSM評估肝臟硬度或肝纖維化程度。LSM越大表示肝組織質地越硬，纖維化程度越嚴重。分別在治療前及治療48周及96周時各檢查1次。對比前后硬度值變化。

1.5.3 肝脾超聲積分 采用彩色超聲檢查肝實質、肝臟表面、肝臟邊緣、肝靜脈的情況，并測量計算脾臟面積。最終計算肝脾超聲參數積分以評估肝臟的纖維化、硬化程度[11]。在治療前及治療48周，96周時各檢測1次。具體積分標準見表1。

表1 肝脾超聲參數積分標準

1.5.4 血清低氧誘導因子1α(HIF-1α)、血管內皮生長因子(VEGF)水平檢測 采取患者外周血2 ml，離心，取血清，ELISA法檢測，采用美國R&D公司試劑盒，在治療前和治療96周時各檢測1次。

1.5.5 檢測肝組織HIF-1α、VEGF表達 在治療前及治療96周時分別行肝穿刺取肝組織，按1.5.1中方法處理，采用免疫組織化學法檢測HIF-1、VEGF的表達情況，免疫組化超敏試劑盒及DAB顯色試劑盒購自福建福州邁新生物技術開發有限公司。

1.5.6 肝組織的微血管密度(MVD)水平計算 在治療前及治療96周時，按上述方法取得肝組織冰凍切片。參照Weidner等[12]的方法，通過免疫熒光檢測CD31蛋白表達計算MVD，低倍鏡下觀察整個切片，尋找血管密度最高的區域，然后高倍鏡下每張切片隨機選取5個視野，采用image proplus 6.1圖像分析軟件計算每個視野陽性染色微血管數目，并求平均值。

2 結果

因肝活檢穿刺為有創檢查，部分患者拒絕進行第二次肝活檢穿取標本，因此本研究最后對照組只有26例，治療組有52例患者完成二次肝穿活檢。

2.1 兩組患者治療前及治療96周時肝組織Knodell、Ishak評分情況 見表2。

表2 兩組患者治療前及治療96周時肝組織兩項評分比較

2.2 兩組患者治療前及治療兩時段時LSM、肝脾超聲積分檢測結果 見表3。

表3 兩組患者治療前及治療兩時段時LSM、肝脾超聲積分比較

2.3 兩組患者治療前后血清中HIF-1α、VEGF檢測結果 見表4。

表4 兩組患者治療前后血清中HIF-1α、VEGF結果比較

2.4 兩組患者治療前后肝組織中HIF-1α、VEGF、MVD檢測結果 見表5。

表5 兩組患者治療前后肝組織中3項指標結果比較

3 討論

近年來通過抑制血管增生進而阻止肝纖維化的發生成為研究的熱點。血管新生是一種缺氧啟動、生長因子依賴的動態病理過程，HIF-1在細胞受低氧刺激時誘導產生并活化，是組織缺氧的直接反映與重要標志[13]。血管增生程度取決于缺氧的程度及細胞對HIF的反應[14]。研究證明，HIF-1α是一種受細胞內氧濃度調節的轉錄因子，隨著肝損傷加重，組織缺氧區域擴大，HIF-1α高表達，可刺激HSC激活并通過誘導下游VEGF因子表達和轉錄，還可增強VEGF mRNA的穩定性，促進形成新血管，改善局部組織血供，暫時緩解肝組織的缺氧程度，但這種異常的血管增生從長遠來看卻是有害的[15,16]。VEGF是目前所知作用最強的直接作用于血管內皮細胞的促血管生成因子，可特異性地促進內皮細胞分裂、增殖和移動，增加血管通透性，在血管形成中起重要作用[17,18]。眾多研究結果顯示，隨著肝纖維化程度的加重，肝纖維化患者血清VEGF水平逐漸升高,因此，調控HIF-1α及VEGF的表達，有望成為抑制肝纖維化的有效方法[19-21]。微血管密度MVD是判斷有無血管新生的特異性指標，呂靖等[22]發現隨著肝纖維化程度加重，微血管的數目或者微血管密度增加，這種病理性血管增生可能通過上調HIF-1α VEGF信號通路中有關信號分子的基因和蛋白表達而實現的。

中醫學理論中無肝纖維化病名，歷代醫家根據患者癥狀、體征將其分屬于“鼓脹”“脅痛”“癥瘕”“積聚”等范疇，認為肝纖維化的根本病因是正氣虧虛、濕熱疫毒內侵，導致肝失調達、肝氣郁結、瘀阻脈絡。肝病日久，可累及脾腎二臟，三臟虧虛，濕熱、瘀毒與正虛相互夾雜，發為本病。因此，濕熱久居肝脾，氣虛血瘀為其基本病機。軟肝顆粒是我科臨床治療肝纖維化、肝硬化的常用藥物，多年來不斷改善配伍。組方針對肝硬化的病機特點，配伍主次有度，方中以穿山甲、鱉甲為君，軟肝散結；三七、桃仁、當歸、丹參為臣，活血化瘀；黃芪、枳殼、茯苓為佐，健脾益氣利濕；生地黃、五味子、葉下珠為佐，清熱解毒養肝。現代藥理研究表明，葉下珠有一定的保肝及直接抗HBV作用；黃芪、生地黃均有增強機體免疫功能的作用；當歸除提高免疫功能外還有保肝、抗肝纖維化的作用；五味子有較強的護肝及調節免疫功能作用；丹參、桃仁、三七、鱉甲均證實有抗肝纖維化作用。

本研究結果提示軟肝顆粒能夠抑制肝組織及血清中HIF-1α、VEGF細胞因子的表達，改善肝硬化患者組織微血管密度，減輕肝纖維化程度，延緩病情進展，臨床療效滿意。

軟肝顆粒具有抗纖維化作用，其與下調細胞因子、抑制血管新生相關。隨著對細胞因子與血管新生，及血管新生與肝纖維化作用機制的進一步深入研究，將來可能可以通過抗體或基因水平干預這些因子及其受體的作用，從而抑制細胞缺氧及血管生成，從而抑制肝纖維化，防止肝纖維化向肝硬化進展。