豬源大腸桿菌耐藥性及相關耐藥基因檢測

孫慧琴，軒慧勇，買占海，楊紫嫣，夏利寧

(新疆農業大學動物醫學學院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】大腸桿菌(Escherichiacoli)是一種典型的革蘭氏陰性無芽孢直桿菌，是人和動物腸道菌群的重要組成部分，在衛生學上被作為衛生監督的指示菌[1]。【前人研究進展】大腸桿菌作為條件性致病菌，在一定條件下可引起人體或動物胃腸道感染、尿道感染、關節炎、腦膜炎以及敗血型感染等疾病，在細菌引發的疾病中居世界首位[2]。抗菌藥物的壓力選擇下使細菌產生耐藥性和抗生素抗性基因[3]。【本研究切入點】大腸桿菌作為人和動物的腸道共棲菌以及耐藥基因貯存庫，可以通過質粒和耐藥基因傳遞等多種方式將耐藥性傳播給人類[4]。目前有關新疆阿克蘇地區豬源大腸桿菌的耐藥情況鮮見報道。研究豬源大腸桿菌耐藥性及相關耐藥基因檢測。【擬解決的關鍵問題】研究新疆阿克蘇地區某規模化養豬場豬源大腸桿菌耐藥性以及對耐藥菌株進行相關耐藥基因檢測。分析該地區豬源大腸桿菌耐藥現狀及耐藥基因攜帶情況，為該地區大腸桿菌流行病學研究和臨床用藥提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品來源

2018年11月9～12日，在新疆阿克蘇地區某規模化豬場進行豬源肛拭子的采集。通過滅菌棉簽采集豬直腸糞樣于裝有1 mL MH肉湯的2 mL EP管中，共采集1 203份樣品，分離試驗用大腸桿菌。

1.1.2 菌株及培養基

大腸桿菌標準質控菌(ATCC 25922)購自杭州天和微生物試劑有限公司；麥康凱培養基、普通肉湯和Mueller-Hinton(MH)培養基均購自北京奧博星生物技術有限公司。

1.1.3 藥 品

酰胺醇類：氟苯尼考(FFC/含量98.0%)；喹諾酮類：環丙沙星(CIP/含量93.9%)、諾氟沙星(NOR/含量99.9%)和恩諾沙星(ENR/含量100%)；氨基糖苷類：鏈霉素硫酸鹽(STR/含量95.0%)、慶大霉素硫酸鹽(GM/含量59.0%)、阿米卡星(AMK/含量99.1%)、安普霉素(APR/含量599 μ/mg)、鹽酸大觀霉素(SPT/含量97.0%)；四環素類：鹽酸土霉素(OTC/含量89.5%)、鹽酸金霉素(AM/含量90.0%)；β-內酰胺類：頭孢噻呋(CEF/含量89.6%)；多肽類：多黏菌素E(CL/含量100%)。

1.2 方 法

1.2.1 大腸桿菌的分離鑒定

用滅菌棉簽輕輕旋轉插入豬的肛門內，將沾有糞樣的棉簽放入含有1 mL滅菌MH肉湯的2 mL EP管中。置于37℃恒溫培養箱內增菌培養3～6 h，用接種環蘸取少量增菌液在麥康凱瓊脂平板上劃線，倒置于37℃恒溫培養箱內培養24 h后，挑取平板上粉紅色的單菌落，為疑似大腸桿菌，對分離到的疑似大腸桿菌進行大腸桿菌管家基因uidA的鑒定[5]，uidA基因PCR擴增反應體系(20 μL)：2 ×TaqPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，模板0.5 μL，dd H2O 8.5 μL，用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測后將目的片段進行膠回收并送上海生物工程技術服務有限公司測序。確定為大腸桿菌的菌株，用滅菌的60%甘油保菌，于-20℃保存備用。

1.2.2 藥物敏感性

按歐盟藥敏試驗標準委員會(EUCAST)推薦的瓊脂稀釋法[6]，對分離得到的大腸桿菌進行臨床常用13種抗菌藥物最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)值測定。以ATCC 25922菌株作為標準質控菌，結果判定參照EUCAST標準，以敏感、中介和耐藥3種形式記錄結果。表1

表1 引物序列Table 1 The primer sequences

1.2.3 DNA模板制備與耐藥基因的檢測

將純化的大腸桿菌復蘇后劃線接種在麥康凱固體培養基上，倒置于37℃恒溫培養箱過夜培養。挑取1個單菌落至裝有50 μL Tris-EDTA 緩沖液的滅菌八聯管中。95℃煮沸15 min，12 000 r/min離心10 min，取上清，-20℃保存備用。

根據相關參考文獻[7～10]合成4大類10種耐藥基因(酰胺醇類floR；喹諾酮類qnrS、qnrD、oqxA、oqxB；氨基糖苷類ant(3″)-Ia、aac(6′)-Ib、rmtB；四環素類tetM、tetK)，引物序列具體信息見表2。引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳后經凝膠成像系統拍照分析，將目的片段進行膠回收并送上海生物工程技術服務有限公司測序，獲取的序列利用NCBI網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BLAST程序進行比對分析，最后確定基因型。表2

2 結果與分析

2.1 大腸桿菌的分離鑒定

共采集阿克蘇地區某規模化養豬場1 203份樣品，經過麥康凱培養基2次純化及大腸桿菌管家基因uidA鑒定后，最終分離出大腸桿菌443株，總體分離率為36.8%。

2.2 大腸桿菌藥敏

研究表明，大腸桿菌對土霉素的耐藥率最高(100%)；對金霉素(99.0%)、鏈霉素(99.0%)、大觀霉素(95.0%)、恩諾沙星(92.0%)的耐藥率均高于90.0%；對慶大霉素(81.0%)、氟苯尼考(75.0%)、環丙沙星(73.0%)的耐藥率均高于70.0%；對諾氟沙星(48.0%)耐藥率未超過50.0%；對阿米卡星(4.9%)、安普霉素(16.6%)、頭孢噻呋(23.5%)和多黏菌素E(15.8%)具有較好的敏感性，耐藥率未超過25.0%。圖1

表2 耐藥基因引物序列Table 2 The resistant genes primer sequences

2.3 大腸桿菌多藥耐藥結果

研究表明，該豬場大腸桿菌對被檢13種抗菌藥物的多藥耐藥在0耐(0.2%)和3～13耐有分布，以7～9耐為主，占63.6%，且以9耐最高，為26.1%。圖2

2.4 大腸桿菌耐藥基因檢出結果

研究表明，對floR(66.4%)和ant(3″)-Ia(66.4%)檢出率最高；對qnrS(31.4%)和tetM(31.4%)檢出率次之；對aac(6′)-Ib(17.8%)、oqxA(17.6%)、oqxB(17.4%)、rmtB(4.3%)、qnrD(1.4%)耐藥基因均有檢出，未檢出tetK基因。

3 討 論

3.1 大腸桿菌耐藥

大腸桿菌的分離率僅為36.8%，分離率遠低于南海辰(83.6%)[9]和程偉華(99.9%)[11]所報道的菌株分離率，與張瑜(54.0%)[12]報道的豬源大腸桿菌的分離率較為相近，高于王桂琴[13]報道的奶牛乳房炎大腸桿菌分離率(7.51%～15.84%)。分析大腸桿菌分離率較低的原因是，11月新疆阿克蘇地區氣溫較低，低溫季節不利于菌株的生長和繁殖[14]，可能會導致所采樣品中活菌數量較少；此外，從阿克蘇到烏魯木齊有長達1 015.3 km的路途，樣品運輸時間較長，未能及時增菌致使部分樣菌失活，可能也是導致分離率較低的原因之一。

藥敏試驗結果表明，該養殖場豬源大腸桿菌對被檢抗菌藥物呈現高耐藥和高敏感現象。對酰胺醇類、喹諾酮類和四環素類抗菌藥物的耐藥情況嚴重，耐藥率均高達90%以上，耐藥率由高到低依次為土霉素>金霉素=鏈霉素>大觀霉素>恩諾沙星>氟苯尼考>環丙沙星，耐藥結果高于軒慧勇[15]的報道，但與李崇[16]報道的廣西某地區的耐藥結果一致。長期反復的使用喹諾酮類和酰胺醇類抗菌藥物，盡管采用聯合用藥方式，但隨著該類抗菌藥物的廣泛使用，導致該養殖場大腸桿菌對氟喹諾酮類和酰胺醇類的耐藥情況嚴重，且存在交叉耐藥[17]；由于加大劑量用藥甚至是不按療程用藥，不僅導致藥物殘留，也使菌株產生耐藥。

盡管該養殖場耐藥情況嚴重，但對被檢的氨基糖苷類、β-內酰胺類和多肽類的抗菌藥物具有較好的敏感性，與傅力等[18]報道的耐藥結果一致。

由于該養殖場呈現高耐藥和高敏感結果，所以該養殖場的多藥耐藥集中在7～9耐，并以9耐譜型FFC+CIP+NOR+ENR+STR+GM+SPT+AM+OTC為主，該養殖場可結合藥敏試驗結果，在目前的用藥模式上調整或合理選用具有較高敏感性的抗菌藥物，結合其他未使用過的抗菌藥物進行聯合用藥并規范用藥，在提高治療效果的同時，也降低該養殖場豬源耐藥大腸桿菌的出現。

3.2 大腸桿菌耐藥基因檢測

耐藥基因與耐藥表型基本一致，研究耐藥基因檢測結果顯示，對喹諾酮類耐藥率在70.0%～90.0%，對喹諾酮類耐藥基因檢出率為67.8%(31.4%攜帶qnrS基因、17.6%攜帶oqxA基因、17.4%攜帶oqxB基因、1.4%攜帶qnrD基因)；對酰胺醇類耐藥率為75.0%，對酰胺醇類floR基因檢出率為66.4%；對部分氨基糖苷類耐藥率高達90.0%以上，對氨基糖苷類耐藥基因檢出率高達88.5%(66.4%攜帶ant(3″)-Ia基因、17.8%攜帶aac(6′)-Ib基因、4.3%攜帶rmtB基因)，以上結果表明，細菌攜帶的耐藥基因在細菌產生耐藥中具有重要的作用。同時，試驗結果顯示，該養殖場對酰胺醇類和氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥主要是由于攜帶floR(66.4%)和ant(3″)-Ia(66.4%)耐藥基因所致，對喹諾酮類抗菌藥物的耐藥主要是由于攜帶qnrS(31.4%)耐藥基因；對四環素類的耐藥主要是tetM(31.4%)耐藥基因所致，但對四環素類耐藥率高達95.0%以上，但四環素類耐藥基因檢出率僅為31.4%，眾所周知，細菌產生耐藥性的機制十分復雜，存在多個同類耐藥基因共同介導一種藥物耐藥的現象，比如對四環素類抗菌藥物產生耐藥，不僅是tetM、tetK這2個基因決定，還有其他基因(如tetA、tetB等)[19]和質粒介導的耐藥，甚至是新的耐藥基因(如tetX3、tetX4)[20]、耐藥決定區基因的變異和新的耐藥機制同樣介導細菌耐藥的產生。研究所選取的10種耐藥基因僅是4大類抗菌藥物中的主要耐藥基因，細菌對上述被檢抗菌藥物耐藥的產生可能是由于這些耐藥基因所介導，阿克蘇地區豬源大腸桿菌很可能還存在其他非耐藥基因介導或未知耐藥基因介導的耐藥機制。

4 結 論

新疆阿克蘇地區某規模化豬場豬源大腸桿菌對被檢的13種抗菌藥物耐藥結果呈現高耐藥和高敏感，對臨床常用抗菌藥物如氟苯尼考、環丙沙星等耐藥率高達90%以上；對阿米卡星、多黏菌素E等具有較好的敏感性；多藥耐藥集中在6～9耐，主要以攜帶floR和ant(3″)-Ia基因為主。因此，該豬場在治療大腸桿菌病時應結合藥敏試驗結果，合理輪換使用抗菌藥物，同時加強環境消毒意識，減少菌株間耐藥性的傳播。