褪黑素對糖尿病大鼠心功能及氧化應激反應的影響

孫權 徐偉明 韓雪 張鵬霞 孟德欣

(1佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154002；2濰坊市坊子區仁康醫院；3保山中醫藥高等專科學校)

當今，全球糖尿病患者已經超出2億例，在我國糖尿病患者超過7 000萬例〔1〕。糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病引起的一種心臟疾病〔2〕，主要病理特征為心肌間質增生、細胞肥大、增殖、凋亡等，臨床表現主要以心臟舒張功能缺陷為主、左心室重構，隨病情加重、病變進展出現心臟收縮功能異常〔3〕。氧化應激是由于多種因素刺激機體，體內產生超量的活性氧簇(ROS)；機體內抗氧化能力下降，進而機體內氧化-還原反應平衡被打破，氧化損傷嚴重，導致生命活動受到影響的一種狀態〔4〕。糖尿病引起的高血糖和高脂肪酸能夠誘導氧化應激，產生過量的ROS，高血糖所致的糖基化終末產物(AGEs)異常升高也可導致心肌細胞ROS大量產生〔5〕。ROS在體內過多產生或者消除減少，會直接引起生物膜脂質過氧化、細胞內蛋白及酶變性、DNA受損、細胞死亡或凋亡，造成組織損傷。褪黑素(MT)屬于吲哚類激素，由松果體分泌，是具有很強的抗氧化劑，高效清除體內過多的氧自由基〔6〕，高效增強機體內超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低過氧化脂質(LPO)和血清丙二醛(MDA)存量〔7，8〕，另外可通過誘導抗氧化防御酶和抑制整個細胞凋亡，從而充分發揮其抗氧化能力，對許多疾病防治療效甚好。本文擬分析MT對糖尿病大鼠心功能及氧化應激反應的影響。

1 材料與方法

1.1材料 體重(200±20)g，雄性Wistar大鼠(由長春億斯實驗動物技術有限責任公司提供)80只，清潔級，常規飼養于佳木斯大學提供的動物實驗中心，每天12 h日常光照，室內氣溫、濕度正常，正常飲食。鏈脲佐菌素(STZ)由美國Sigma公司提供；MT由浙江黃巖延年褪黑素有限公司提供。

1.2分組和建立模型 大學實驗動物中心適應環境性喂養1 w后，按隨機分配原則分組：正常組、模型組、低劑量MT組(10 mg/kg體重)和高劑量MT組(20 mg/kg體重)，一組20只，每5只一籠飼養。

除正常組外的3組都給予高脂高糖飲食4 w后，實驗大鼠禁食12 h，1%STZ 50 mg/kg體重腹腔注射，72 h尾靜脈采血測血糖，在以后實驗過程中每4 w測一次血糖，達到空腹血糖≥16.7 mmol/L以上，視為糖尿病大鼠模型成功。正常組按照同等劑量注射檸檬酸緩沖液。造模成功之后，每天一次10∶00～14∶00灌胃MT，低劑量MT組按10 mg/kg體重，高劑量MT組按兩倍低劑量組，剩余兩組給予同等劑量的生理鹽水，一直持續至16 w。

1.3取材 用藥前、后對空腹血糖進行測量。禁食、水12 h后，大鼠尾靜脈采血，動物血糖儀測出血糖值。斷髓法處死大鼠，剖開大鼠胸腔，心臟暴露眼前。順著大鼠心底大血管根部剪斷心臟，剪開心耳，心室進針，0.75%鹽水沖洗，多聚甲醛固定，10%中性甲醛浸泡，蠟塊包埋，制成5 μm厚石蠟切片。

1.4指標觀察 ①使用生理記錄儀，記錄大鼠心臟左室收縮壓(LVSP)、左室舒張期末壓(LVEDP)、室內壓最大上升速率(+dp/dtmax)、室內壓最大下降速率(-dp/dtmax)和室內壓上升達最大速率所需時間(t-dp/dt)。②HE染色觀察心肌組織的形態變化。③比色法測定各組心肌組織中氧化應激指標，制備10%心肌組織勻漿后，利用可見光分光光度計，測定各組心肌組織中MDA、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)含量的變化。

1.5統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1MT對心臟功能的影響 與正常組比較，模型組心功能LVSP降低、LVEDP升高、+dp/dtmax和-dp/dtmax降低、t-dp/dt升高，差異具有顯著性(P<0.05)；與正常組比較，MT各組心功能LVSP、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、t-dp/dt差異無統計學意義(P>0.05)；與模型組比較，MT各組心功能LVSP升高、LVEDP降低、+dp/dtmax和-dp/dtmax升高、t-dp/dt降低，差異具有顯著性(P<0.05)，低劑量組和高劑量組差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組心功能指標比較

2.2HE染色結果 普通光鏡下觀察結果，顯示正常組心肌細胞結構清晰，排列整齊，層次鮮明，核圓形或橢圓形，染色質分布均勻，心肌間隙清晰可見，膠原纖維著色淡，分布稀疏；模型組心肌結構不清，排列雜亂，組織腫脹，細胞間質及毛細血管增生，胞體增大，大小不均，排列雜亂，胞質豐富，胞質變淺，胞核呈現長桿狀，排列雜亂，核膜皺縮，核固縮，有呈雙核，染色質呈顆粒狀。MT處理過后心肌間隙清晰，心肌細胞排列整齊，結構清晰，胞核形態正常，染色質均勻，低劑量MT組較明顯。見圖1。

圖1 各組心肌組織(HE，×200)

2.3各組MDA、CAT和GSH-PX含量 經過MT灌胃16 w后，與模型組比較，MT用藥組MDA含量明顯降低(P<0.05),CAT和GSH-PX含量明顯升高(P<0.05)；而與正常組比較，模型組MDA含量顯著升高，CAT、GSH-Px顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組心肌組織中MDA、CAT和GSH-PX含量測定

3 討 論

高血糖可導致心臟膠原沉積并且誘發心肌間質纖維化程度加重，致使AGEs含量升高，心肌硬度增加，引發氧化應激增強，激活核因子(NF)-κB調控基因表達，從而改變心肌收縮能力〔9，10〕。MT通過改善胰島素敏感性，下調胰島素抵抗，調節心肌的代謝平衡，使其能更有效清除體內自由基，對抗心肌細胞損傷。

有學者研究表明，STZ誘導的糖尿病大鼠心肌細胞超微結構改變，心功能下降〔11〕。本實驗說明MT對糖尿病大鼠心肌具有保護作用。體內的氧化應激反應是氧化與抗氧化動態平衡的破壞因素之一，導致體內炎性細胞過度浸潤，氧化代謝的中間產物——ROS大量產生、聚集。ROS是導致人體衰老及各種疾病所不可忽視的因素。ROS以游離的自由基形式存在于體內，主要含有超氧陰離子(O2-)、H2O2和OH等等。機體內造成組織嚴重損害正是由于ROS的大量堆積，驅使細胞凋亡。氧化系統和抗氧化系統共存于機體內，抗氧化系統包括兩大類：一是酶類系統，包括SOD、CAT、GSH-PX等；一類是非酶類系統，有GSH、金屬硫蛋白(TM)、維生素C等，還包括微量元素硒、鋅和銅等〔12〕。抗氧化系統直接或間接地降低ROS含量，如CAT主要分解體內的H2O2，降低含量，降低細胞損傷。CAT屬于酶類ROS清除劑，存在于動物機體組織細胞內，動物肝臟內濃度最高，成為防御體系的重要酶，催化H2O2分解成H2O與O2，使機體細胞免于遭受H2O2的毒害；GSH-PX廣泛存在機體內，是重要的體內過氧化物分解酶，硒半胱氨酸是GSH-PX的活性中心。包括組織GSH-PX、血漿GSH-PX、磷脂氫過氧化物GSH-PX和胃腸道專屬性GSH-PX等四種。CAT和GSH-PX都是生物機體內研究抗氧化的重要指標。而MDA是機體內重要的氧化常用指標，MDA是機體氧化代謝的終產物，自由基作用于脂質后發生過氧化反應，可引起蛋白質、核酸等生命大分子發生交聯聚合，具有細胞毒性。MDA也會影響線粒體呼吸鏈復合物和線粒體內關鍵酶的活性，加劇質膜損傷。

MT是機體天然抗氧化劑，由松果體分泌，可以自由通過細胞膜，清除自由基可以增強體內抗氧化酶類的活性。MT與膜上受體結合后，由第二信使如環磷酸腺苷(cAMP)介導使胞內磷酸化級聯反應激活相關蛋白，調節抗氧化酶的活性，并影響相關基因的表達。當主動切除松果體后，導致大鼠體內的ROS基團堆積、活性上調、增強氧化應激反應〔13〕。而Kornelia 等〔14〕給予患者外源性MT 1個月后，MDA濃度下降，證明MT可以改善2型糖尿病患者體內的氧化應激反應的狀態。研究表明給予糖尿病患者外源性MT 2個月后，MDA濃度下降，血漿和胞質中GSH-PX活性增加，氧化應激反應水平減緩，空腹血糖和糖化血紅蛋白水平明顯改善〔15〕。Geeta等〔16〕給予STZ誘導的糖尿病大鼠外源性MT后，發現MT可讓部分坐骨神經的傳導速度得到一定恢復，并明顯降低血清內MDA含量，降低了體內氧化應激反應，MT能改善糖尿病患者神經病變得到了進一步的證實。綜上，給予外源性MT可以對抗體內增強的氧化應激反應，可以保護細胞，緩解細胞所受傷害，抵抗機體的應激。MT可通過多條件途徑抑制糖尿病心肌細胞中的過度氧化應激狀態，從而減輕糖尿病大鼠心肌損傷程度。

致謝：感謝黑龍江省北藥與功能食品優勢特色學科建設項目的大力支持。