針灸聯(lián)合自擬茶方調(diào)節(jié)肝AMPK、p38 MAPK、PPARγ信號改善脂肪肝大鼠脂質(zhì)代謝紊亂的機制

胡小軍 訾璐 劉雅婷 李玉婷

(1武漢市普仁醫(yī)院，湖北 武漢 430081；2湖北中醫(yī)藥大學)

糖尿病在中醫(yī)角度歸為“消渴證”，《內(nèi)經(jīng)》中稱為“消癉”，病因主要為陰虛津虧、燥熱偏盛，其中燥熱為標、陰虛為本。中醫(yī)認為，其主要病變部位在肺、胃、腎，基本病機為陰津虧耗，燥熱偏盛。《金匱要略》有專篇對消渴的證治進行闡述，立有白虎加人參湯、腎氣丸等有效方劑，至今為臨床醫(yī)家所推崇。本研究自擬茶方為課題組針對氣陰兩虛合并氣滯血瘀型消渴癥患者擬定的基礎方，臨床使用時在此基礎上進行隨癥加減，并聯(lián)合針灸對糖尿病患者的血糖進行控制。針灸聯(lián)合自擬茶方可較好的控制糖尿病患者血糖水平，且可有效的改善胰島素抵抗情況〔1〕。臨床中對糖尿病患者經(jīng)針灸聯(lián)合自擬茶方治療過程中的血脂水平進行監(jiān)測，結(jié)果表明該方法亦可有效控制糖尿病患者的體重及血脂水平〔2〕。肥胖是胰島素抵抗的重要危險因素，肝臟是脂類代謝的重要場所〔3～6〕，也是胰島素作用的主要靶器官，在胰島素抵抗的發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。本文通過針灸聯(lián)合自擬茶方對脂肪肝大鼠脂質(zhì)代謝紊亂的調(diào)節(jié)作用機制進行研究。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 儀器：全自動多功能酶標儀(美國Perkin Elmer，EnSpire型)；臺式高速冷凍離心機(力康生物醫(yī)療科技控制有限公司，Neofuge 15R型)；全自動生化分析儀(意大利樂高特儀器公司，ECHO型)；潔凈工作臺(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司，SW-CJ-2FD型)；病理切片機(上海徠卡儀器有限公司，RM2016型)；成像系統(tǒng)(日本尼康株式會社，DS-U3型)；凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司，GelDocXR型)。試劑：二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量檢測試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司，批號2015032589)；肝組織腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)抗體(美國Cell Signaling Technology公司，批號2017-ASB2559)；p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)抗體(美國Cell Signaling Technology公司，批號2017-XXD1269)；過氧化物酶體增殖物活化受體(PPAR)-γ抗體(美國Cell Signaling Technology公司，批號2017-BBH0052)。

藥品制備：自擬茶方基本方(黃芪、桑葉、葛根各3 g，赤芍、白芍、玉竹、羅漢果、三七粉各2 g)按照配伍比例混合后加入1 000 ml水浸泡20 min后，武火煎煮至沸騰，自沸騰起開始計時，轉(zhuǎn)為文火煎煮20 min，濾出煎液，加入6倍量水進行二煎，合并兩次煎液后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(轉(zhuǎn)速，溫度)進行濃縮，將煎液濃縮至灌胃濃度。

1.2建模及分組給藥 SPF級SD雌性大鼠40只，體重180～220 g，將大鼠置于溫度25℃，相對濕度是100%，適應性飼養(yǎng)1 w。隨機分為對照組、模型組、陽性對照組及治療組，每組10只。每組大鼠均自由飲水，對照組大鼠以常規(guī)飼料進行飼養(yǎng)。

造模方法：模型級、陽性對照組及治療組以高脂飼料進行飼養(yǎng)。每周測量大鼠體重，飼養(yǎng)8 w后，對模型組大鼠進行高胰島素-正常血糖鉗夾實驗，通過計算葡萄糖輸注率(GIR)以驗證胰島素抵抗肥胖大鼠模型是否建立成功。GIR=穩(wěn)定期葡萄糖的平均輸入速度×178/(60×體重×微量泵校正系數(shù))〔7〕。

陽性對照組灌胃給予吡格列酮生理鹽水溶液，治療組灌胃給予自擬茶方并聯(lián)合針灸治療，對照組及模型組給予等量生理鹽水，按照上述方法每日上午給藥1次，給藥14 d，給藥期間對照組繼續(xù)予以常規(guī)飼料進行飼養(yǎng)，模型組、陽性對照組及治療組給予高脂飼料，各組大鼠均自由飲水及攝食。14 d后以10%水合氯醛0.3 ml/g腹腔注射麻醉大鼠，以腹主動脈采集血液及肝臟組織進行后期測定。

1.3肝指數(shù)的計算 取肝臟組織后稱量肝濕重，計算肝臟指數(shù)，公式：肝指數(shù)(%)=肝濕重/體重×100%〔8〕。

1.4切片的制作 取大鼠肝臟組織在10%多聚甲醛中固定24 h以上，在不同濃度的乙醇溶液(70%、85%、95%和100%)中脫水，然后以萊卡(LEICA)石蠟包埋，后縱向切片(厚度為4 μm)并進行蘇木素-伊紅(HE)染色，以中性樹脂進行封片后置于顯微鏡下觀察。

1.5生化指標測定 采用全自動生物儀測定大鼠血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1、IL-6、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平。

1.6組織勻漿TG、TC、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)檢測 將大鼠肝臟組織勻漿后，以全自動生化儀檢測肝臟組織中TG、TC、MDA及SOD含量。

1.7免疫印跡測定AMPK、p38 MAPK和PPARγ表達 取肝臟組織清洗后，以RIPA裂解液于冰上對組織進行裂解，徹底裂解后置于4℃低溫離心機中，以12 000 r/min離心15 min，取上清液。以BCA法測定蛋白總量，并以丙烯酰胺、鹽酸三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS-Hcl)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、過硫酸銨(AP)及四甲基乙二胺(TEMED)配膠，隨后進行灌膠、上樣、電泳操作。以甲醇活化的聚偏氟乙烯(PVDF)膜進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后加入5%脫脂牛奶進行封閉后，加入一抗于4℃孵育過液，以TBST進行洗膜，5 min/次，清冼3次。加入二抗，于室溫下進行孵于30 min，以TBST洗PVDF膜，5 min/次，清冼3次。以電化學發(fā)光(ECL)試劑進行發(fā)光，置于成像分析系統(tǒng)中〔9，10〕。

1.8統(tǒng)計學分析 采用SPSS20.0軟件進行方差分析，LSD-t檢驗，χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1肝指數(shù) 模型組肝指數(shù)〔(3.97±0.33)%〕高于對照組〔(2.81±0.28)%，P<0.05〕，陽性對照組〔(3.25±0.15)%〕與治療組肝指數(shù)〔(3.18±0.21)%〕均低于模型組(P<0.05)，治療組肝指數(shù)與陽性對照組大鼠相比無顯著性差異(P>0.05)。

2.2肝組織形態(tài) 對照組肝臟組織中肝小葉結(jié)構(gòu)完整且清晰，肝臟細胞形態(tài)正常；模型組肝小葉結(jié)構(gòu)較為模糊，可見彌漫性的肝臟細胞脂肪變性，同時可見大泡性脂肪變性與小泡性脂肪變性，且伴隨炎癥細胞浸潤；陽性對照組及治療組中亦可見彌漫性脂肪變性，但其脂肪變性的面積及程度及炎癥浸潤情況與模型組相比較均有所減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠肝臟組織病理切片(×400)

2.3各組血清各指標檢測結(jié)果比較 模型組TC、TG、LDL-C、ALT、AST、ALP、IL-1、IL-6、TNF-α水平明顯高于對照組，HDL-C水平明顯低于對照組(均P<0.05)。陽性對照組與治療組血清中TC、TG、LDL-C、ALT、ALP、IL-1、IL-6、TNF-α水平明顯低于模型組，HDL-C明顯高于模型組(均P<0.05)。陽性對照組血清中AST水平明顯低于模型組(均P<0.05)。治療組血清中TG、LDL-C、ALP、IL-6水平與陽性對照組比較差異顯著(均P<0.05)。見表1。

表1 各組血脂比較

2.4各組肝組織TC、TG、SOD、MDA指標比較 模型組肝組織TC、TG、MDA水平明顯高于對照組，SOD水平明顯低于對照組(均P<0.05)。陽性對照組TC、TG、MDA水平明顯低于模型組，SOD水平明顯高于模型組(均P<0.05)。治療組TG、MDA水平明顯低于模型組，SOD水平明顯高于模型組(均P<0.05)。治療組與陽性對照組肝組織中TC及TG水平無顯著差異(P>0.05)。治療組肝臟SOD水平高于陽性對照組(P<0.05)，治療組肝臟MDA水平低于陽性對照組(P<0.05)。見表2。

表2 各組肝組織勻漿指標測定結(jié)果比較

2.5各組AMPK、p38MAPK和PPARγ蛋白表達比較 模型組肝臟組織中AMPK及PPARγ表達明顯低于對照組，p38MAPK表達明顯高于對照組(均P<0.05)。陽性對照組、治療組肝臟組織中AMPK及PPARγ表達明顯高于模型組，p38MAPK表達明顯低于模型組(均P<0.05)。治療組AMPK與PPARγ表達與陽性對照組相比差異顯著(均P<0.05)。見圖2，表3。

圖2 大鼠肝臟組織中各蛋白表達結(jié)果

表3 各組AMPK、p38MAPK和PPARγ蛋白表達比較

3 討 論

《素問》有云“膏梁之變，足生大疔”，飲食肥甘厚膩及機體脂質(zhì)代謝紊亂是產(chǎn)生胰島素抵抗的重要原因。自擬茶方由黃芪、桑葉、葛根、赤芍、白芍、玉竹、羅漢果及三七粉組成，黃芪為常用補氣藥，具有補氣升陽、固表止汁、利水消腫等功效，桑葉可疏散風熱、清肺潤燥，葛根具解肌退熱、生津止渴之功效，赤芍具清熱涼血之功，白芍有斂陰止汗之效，羅漢果可清熱潤肺，玉竹可養(yǎng)陰潤燥、生津止渴，三七具有散瘀止血、消腫定痛的功效，諸藥合用可清熱潤燥、固表止汗以治標，又具養(yǎng)陰益氣之效以治本。全方共奏益氣養(yǎng)陰活血通絡之功，以改善咽干口燥、倦怠乏力，多食易饑，口渴喜引、五心煩熱、心悸失眠、便秘舌紅少津苔薄或花剝，脈細數(shù)無力或細弦等癥狀。

自擬茶方聯(lián)合針灸治療在臨床上有效地改善患者的胰島素抵抗情況〔11〕。肝指數(shù)及血清肝酶的情況可反映肝功能情況，血脂及肝勻漿中TG及TC水平反映大鼠脂質(zhì)代謝情況，炎癥因子則與胰島素敏感及脂質(zhì)代謝紊亂具有相關性〔11〕。本文結(jié)果表明，自擬茶方聯(lián)合針灸可改善模型大鼠肝臟細胞脂肪變性程度，有助于脂肪肝大鼠的肝功能恢復，可有效地改善大鼠脂代謝紊亂情況，有效降低血脂水平。

AMPK在調(diào)節(jié)能量代謝中對于葡萄糖攝取及脂肪酸氧化等方面均發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，且敲除AMPK基因可誘導小鼠產(chǎn)生胰島素抵抗，而特異激活AMPK可產(chǎn)生胰島素增敏效應〔12～14〕；PPARγ是過氧化物酶體增殖物激活受體的一種亞型，主要在脂肪組織中表達，研究表明其是胰島素細胞間信號傳導、脂肪細胞基因表達的調(diào)節(jié)者，可增加外周組織對于胰島素的敏感性從而改善胰島素抵抗〔15～18〕；此外，p38MAPK的表達與脂肪肝大鼠中IL-1、IL-6及TNF-α等炎癥因子的釋放具有相關性〔19～22〕。本研究結(jié)果提示針灸聯(lián)合自擬茶方對于脂肪肝大鼠的脂質(zhì)代謝紊亂及胰島素抵抗的改善作用可能與上調(diào)AMPK及PPARγ表達、下調(diào)p38 MAPK相關。