馬氏珠母貝腸道及其養殖水體可培養細菌群落結構

陳 琨，黃 灣，廖永山，楊創業,3，王慶恒,3

（1.廣東海洋大學水產學院// 2.廣東海洋大學珍珠研究所// 3.廣東省海水養殖生物育種工程實驗室,廣東 湛江 524088）

腸道微生物是動物體內最重要微生物群落[1-2]，在宿主生長發育、消化吸收和免疫等生理活動中不可或缺[3-5]。近年來，以16S rRNA 基因序列分析為基礎的變性梯度凝膠電泳技術和高通量測序技術廣泛應用于腸道菌群研究[6-8]。腸道菌群分泌的代謝產物中含多種酶，能參與多糖、氨基酸和外源性化學物質的代謝，促進宿主對營養物質的消化吸收[9]。腸道菌群能刺激腸道上皮細胞增殖，增強宿主的先天免疫應答[10]。此外，腸道菌群失調會導致宿主發育減慢和免疫功能紊亂[11]。研究表明，水產動物腸道菌群結構的動態平衡受自身生理狀態、飼料和水體環境等諸多因素影響[12-15]。養殖水體中含有大量微生物，消耗水體中的有機物，促進物質循環。王賢豐等[16]研究發現，水產動物腸道菌群與其養殖環境菌群密切相關。當環境惡化時，環境菌群生態平衡失調，病原菌就會大量繁殖，從而暴發細菌性疾病[17-18]。目前，關于水產動物腸道及其養殖環境菌群結構的研究主要集中于大菱鲆（Scophthalmus maximus）[19]、擬穴青蟹（Scylla paramamosain）[16]、刺參（Stichopus japonicus）[20]等。

馬氏珠母貝（Pinctada fucata martensii），隸屬于軟體動物門、雙殼綱、珍珠貝目、珍珠貝科，在中國主要分布于廣東、廣西和海南三省沿海地區[21]，是主要海水育珠貝，具有很高經濟價值。但隨著養殖密度和養殖規模擴大，馬氏珠母貝的病害發生日益嚴重，同時自然災害、環境污染、養殖容量等問題也給馬氏珠母貝養殖造成不利影響。因此，分析馬氏珠母貝腸道及其養殖水體菌群結構對馬氏珠母貝健康養殖具有重要意義。本實驗室已利用高通量測序技術分析了不同蛋白源飼料對馬氏珠母貝腸道菌群結構的影響[22]，而關于馬氏珠母貝腸道菌可培養細菌未見報道。

本研究分析海區養殖馬氏珠母貝腸道菌群與養殖水體菌群種類及豐度，以期為認識馬氏珠母貝腸道菌群結構、益生菌篩選和病害防治，構建馬氏珠母貝生態健康養殖技術提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

馬氏珠母貝為2 齡貝，殼長（62.3±6.1）mm，取自廣東雷州覃斗鎮后洪村養殖區，清洗表面附著物，同時采集養殖海區水樣放置于無菌采水瓶。所采集的樣品于冰盒中運送至實驗室。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 用體積分數75%乙醇擦拭馬氏珠母貝體表，在超凈工作臺剖取腸道，無菌海水沖洗3 次后置于滅菌離心管中，加入1 mL 無菌海水作為勻漿液，用頻率為24 Hz 組織勻漿機對腸道樣品勻漿2 min，重復勻漿1 次，將勻漿液稀釋100倍后，取100 μL 涂布于2216 E 固體培養基上，28 ℃恒溫恒濕培養7 d 并統計菌落數，根據活菌計數法計算樣品可培養細菌的數量。同時在每個梯度的平板上各隨機挑取50 個菌落，在2216E 固體培養基上劃線純化，將純化后菌株保存于2216E 斜面備用。

養殖海區水樣在無菌環境中稀釋10 倍，取100 μL涂布于2216E固體培養基上，后續步驟同上。

1.2.2 細菌DNA的提取、PCR擴增及序列測定 水浴法提取細菌DNA：用無菌牙簽蘸取少量劃線純化的單個菌落，混于裝有20 μL 滅菌ddH2O 的離心管中，置于沸水中水浴2 min 后，迅速置于冰上，使細胞裂解，釋放出DNA，-20 ℃保存備用。對于水浴法擴增不出的菌株采用細菌基因組試劑盒（OMEGA）提取，詳細步驟參照說明書進行。以所提取的細菌DNA 作為模板，細菌通用引物[27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)]為擴增引物，擴增細菌16S rRNA 基因片段。PCR 反應體系：基因組DNA 模板 (10～100 ng/μL) 0.5 μL，引物27F (20 pmol/L) 0.5 μL，引物1492R (20 pmol/L) 0.5 μL，10×PCR buffer 5.0 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 1 μL，rTaq DNA 聚合酶 (Takara 10 U/μL) 0.2 μL，補充ddH2O至50 μL。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；55 ℃30 s；72 ℃ 90 s，33～ 35 個循環；72 ℃ 10 min；4 ℃下保存。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物是否符合目標條帶，PCR 產物的測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.3 序列注釋

利用在線公共數據庫 EzBiCloud（http://www.ezbiocloud.net/eztaxon）進行各菌株序列的同源性比對，從比對結果中選取相似性最高的序列進行注釋。

2 結果與分析

2.1 可培養細菌計數

馬氏珠母貝腸道勻漿液可培養細菌數量為1.72×105CFU·mL-1，其所在養殖水體中可培養細菌計數量為2.15×104CFU·mL-1，可見馬氏珠母貝腸道可培養細菌數量多于養殖海區水體可培養細菌。

2.2 各樣品細菌群落組成

從腸道和養殖水體獲得各150 個純化菌株，經16S rRNA 基因擴增和序列比對后表明，本次檢測中獲得所有菌株與數據庫中相關菌株的16S rRNA基因序列相似性為99%，歸屬于2 個門、3 個綱、7個目、10 個科、23 個屬、56 個種，腸道和水體樣品在不同分類水平上菌群組成存在較大差異（表1），腸道樣品在分類水平上所包含的種類少于養殖水體樣品。

表1 馬氏珠母貝腸道和養殖水體菌群基本構成Table 1 Composition of bacterial communities in different samples

2.3 門和綱水平的細菌組成結構分析

如表2 所示，馬氏珠母貝腸道樣品150 株細菌歸屬于2 門2 綱，即變形菌門Proteobacteria 的γ-變形菌綱 Gammaproteobacteria 和厚壁菌門Firmicute 的芽孢桿菌綱Bacilli。其中，變形菌門和γ-變形菌綱分別為優勢門和優勢綱，均占菌株總數的97.3%。

表2 馬氏珠母貝腸道和水體中菌群的組成比例（綱水平）Table 2 Proportion of microflora in the tract of Pinctada fucata martensii and the water (at class level)

養殖水體樣品150 株細菌同樣歸屬于變形菌門和厚壁菌門，兩者分別占菌株總數的91.3%和8.7%。與腸道菌群不同，水體樣品中變形菌門細菌由α-變形菌綱Alphaproteobacteria 和γ-變形菌綱組成，且前者為優勢群體，占菌株總數的69.3%。γ-變形菌綱和厚壁菌門的芽孢桿菌綱分別占22.0%和8.7%。

2.4 目和科水平的細菌組成結構分析

如圖1 所示，在目水平上，本研究獲得的馬氏珠母貝腸道可培養細菌分屬 4 目，即弧菌目Vibrionales、海洋螺菌目Oceanospirillales、交替單胞菌目Alteromonadales 和芽孢桿菌目Bacillales。其中，弧菌目為優勢群體，占菌株總數的76.0%，其次為交替單胞菌目，為20.7%。

圖1 馬氏珠母貝腸道及其養殖水體培養細菌群落組成（目水平）Fig.1 Culturable bacterial community compositions in Pinctada fucata martensii and water (at order level)

在目的水平上，養殖水體中可培養細菌的生物多樣性明顯優于腸道菌群，分屬于7 個目，分別為紅細菌目Rhodobacterales、弧菌目、芽孢桿菌目、海洋螺菌目、根瘤菌目Rhizobiales、交替單胞菌目和假單胞菌目Pseudomonadales。優勢群體與腸道菌群也有明顯差異，數量最多的是紅細菌目，占菌株總數的68.0%，其次才是弧菌目，為18.0%。

如圖2，在科水平上，馬氏珠母貝腸道可培養細菌分屬5 科，即弧菌科Vibrionaceae、假交替單胞菌科 Pseudoalteromonadaceae、希瓦氏菌科Shewanellaceae、鹽單胞菌科Halomonadaceae 和芽孢桿菌科Bacillaceae。其中，弧菌科為優勢菌科，占菌株總數的76.0%，其次為假交替單胞菌科，為18.7%。

圖2 馬氏珠母貝腸道及其養殖水體可培養細菌群落組成（科水平）Fig.2 Culturable bacterial community compositions in Pinctada fucata martensii and water (at family level)

養殖水體中可培養細菌的科數量多于腸道樣品，共有 9 個科，主要菌科為紅桿菌科Rhodobacteraceae（68.0%）、弧菌科Vibrionaceae（18.0%）、芽孢桿菌科Bacillaceae（8.7%），優勢菌科與腸道樣品菌群也存在明顯差異。

2.5 屬水平的細菌組成結構分析

本研究從馬氏珠母貝腸道和養殖水體分離的可培養細菌分屬23 屬。其中，4 個屬為二者共有；2 個屬為馬氏珠母貝腸道特有菌；17 個屬僅從養殖水體中分離獲得（表3）。

表3 馬氏珠母貝腸道及其養殖水體共有、特有細菌的群落組成（屬水平）Table 3 Culturable bacterial community in Pinctada fucata martensii and water (in genes)

在數量組成上，二者有明顯差異。其中，馬氏珠母貝腸道菌群的優勢屬分別為弧菌屬Vibrio（74.7%）、假交替單胞菌屬Pseudoalteromonas（18.7%）、芽孢桿菌屬Bacillus（2.7%）和希瓦氏菌屬Shewanella（2.0%）；養殖水體的菌群的優勢屬分別為α-變形菌綱的FJ943236_g屬（40.7%）、弧菌屬（16.7%）、魯杰氏菌屬Ruegeria（6.7%）和芽孢桿菌屬（5.3%）。

2.6 種水平的細菌組成結構分析

本實驗從馬氏珠母貝腸道及其養殖水體中共分離出可培養細菌56 種。其中有7 個種為2 個樣品共有；18 個種為馬氏珠母貝腸道特異性菌株；有31 個種僅從養殖水體種分離出來（表4）。

表4 馬氏珠母貝及其養殖水體可培養細菌的群落組成（種水平）Table 4 Culturable bacterial community in Pinctada fucata martensii and water (in species)

馬氏珠母貝腸道種γ-變形菌綱的弧菌占較大比例 (74.7%)，其中主要弧菌為新喀里多尼亞弧菌Vibrio neocaledonicus、強壯弧菌Vibrio fortis和坎氏弧菌Vibrio campbellii。而養殖水體種占優勢的菌種為α-變形菌綱的FJ943236_s(40.7%)。

3 討論

馬氏珠母貝腸道勻漿液可培養細菌數量為1.72×105CFU·mL-1，大于其所在養殖水體2.15×104CFU·mL-1，這與其他貝類研究結果類似，例如紫扇貝幼體中可培養細菌數量比其養殖水體細菌大4 個數量級[23]。初步推測貝類可富集其周圍環境微生物，這可能與宿主為腸道菌群提供所需的生境及營養物質有關[24]；支持了之前學者研究結果：水產動物腸道是許多細菌，包括致病菌的“儲藏基地”[25]。

本研究分離獲得馬氏珠母貝腸道和養殖區海水中的可培養細菌分別為25 種和38 種，均隸屬于變形菌門和厚壁菌門，其中變形菌門占絕對優勢，相對豐度為分別為97.3%和91.3%。Liao 等[22]利用高通量測序研究發現，變形菌門和厚壁菌門是馬氏珠母貝腸道中的優勢菌門，其相對豐度分別為52.7%和23.2%。孫雪瑩[26]研究發現，扇貝幼體不同發育時期及其育苗池水體中優勢菌為變形菌門，其次為厚壁菌門。大扇貝（Pecten maximus）[27]、蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）[28]和牡蠣（Crassostrea gigas）[17]養殖水體優勢門也為變形菌門。通過高通量焦磷酸測序研究3 種牡蠣樣品細菌組成發現，主要優勢菌均為變形菌門[29]。由此可見，海洋貝類細菌組成在門水平上存在極大相似性，變形菌門是貝類的常見細菌門類，其在不同貝類腸道中發揮的作用有待進一步研究。

本研究顯示，馬氏珠母貝腸道可培養菌的優勢綱為γ-變形菌綱，芽孢桿菌綱其次。這與李明等[30]從蝦夷扇貝分離的150 株細菌結果類似。Schulze等[31]運用DGGE 方法研究雙殼貝類細菌群落組成發現，γ-變形菌綱是牡蠣成體、花斑鮑（Haliotis kamtschatkana）幼體、菲律賓蛤仔（Venerupis philippinarum）成體、太平洋潛泥蛤（Panopea abrupta）成體、蝦夷扇貝成體的優勢菌綱。本研究中，馬氏珠母貝養殖海區可培養菌的優勢綱為α-變形菌綱、γ-變形菌綱和芽孢桿菌綱，該結果與蝦夷扇貝、紫扇貝（Argopecten purpuratus）養殖水體相關細菌群落結構一致[23,26]，γ-變形菌綱也是大扇貝幼體培育水體的主要細菌[32]。α-變形菌綱為大扇貝、太平洋牡蠣養殖海水中的第一優勢綱[17,27]。

屬水平上，本研究共獲得馬氏珠母貝腸道可培養細菌6 個屬，主要優勢屬為弧菌屬和假交替單胞菌屬，分別占菌株總數74.7%和18.7%。Liao 等[22]通過高通量測序發現馬氏珠母貝腸道細菌多樣性豐富，其中未知細菌相對豐度為15.6%，主要可鑒定屬為支原體屬Mycoplasma（14.0%）、乳球菌屬Lactococcus（10.9%）、假單胞菌屬Pseudomonas（9.4%）和弧菌屬（6.1%）。研究表明，弧菌屬和假交替單胞菌屬也是蝦夷扇貝和紫扇貝腸道細菌的優勢屬[23,26]。Najiah 等[33]研究發現長牡蠣可培養細菌的優勢屬為假單胞菌屬和弧菌屬，而在熱帶牡蠣（C.iredalei）中，希瓦氏菌屬和弧菌屬是優勢菌。香港巨牡蠣（C.hongkongensis）的相關研究同樣發現了假交替單胞菌屬、弧菌屬、鹽單胞菌屬、希瓦氏菌屬和芽孢桿菌屬為其成體可培養細菌的重要屬類[34]。這些研究進一步表明，雙殼類的腸道可培養菌具有相似性。在養殖水體方面，本研究獲得的可培養菌第一優勢屬為α-變形菌綱的FJ943236_g屬，弧菌屬為第二優勢屬。弧菌屬和假交替單胞菌屬曾從包括蝦夷扇貝、大扇貝在內的魚和貝類養殖水體中分離出來[31]。另外，地中海牡蠣養殖水體存在假交替單胞菌屬和希瓦氏菌屬[35]。弧菌屬、假交替單胞菌屬和希瓦氏菌屬是歐洲牡蠣成體及養殖水體可培養細菌的優勢菌[36]。

腸道和養殖水體中共有菌有芽孢桿菌屬、假交替單胞菌屬、發光桿菌屬和弧菌屬。芽孢桿菌屬隸屬厚壁菌門、芽孢桿菌綱，是養殖貝類和養殖水體中常見微生物類群。芽孢桿菌能改善水產動物腸道菌群結構，增加有益菌數量，抑制病原菌繁殖，從而增強腸道消化酶活性和免疫力，進而提高宿主生長[37]，是目前常用微生態制劑[38]。假交替單胞菌屬、發光桿菌屬和弧菌屬都隸屬變形菌門、γ-變形菌綱。Aranda 等[39]研究發現，假交替單胞菌DIT09、DIT44和DIT46 菌株對副溶血弧菌有較強的抑制效果，可作為新型抑菌劑。同樣Kesarcodi-Watson 等[40]研究發現D41 菌株對燦爛弧菌有抑制效果，可以提高太平洋牡蠣的存活率。而Torkildsen 等[41]研究發現大扇貝幼體感染假交替單胞菌LT13 菌株后，死亡率高達67%。這些細菌對馬氏珠母貝的作用還有待進一步研究，有望從中篩選出馬氏珠母貝特異性益生菌。

弧菌屬是2 個樣品共有的優勢菌，該屬細菌分布廣、種類多，在水產動物腸道及海水中常見，許多成員被認為是條件致病菌，能夠引起魚類、蝦類和貝類的致病和死亡[42]。本實驗中，馬氏珠母貝腸道及其養殖水體中共有弧菌屬的成員有坎氏弧菌Vibrio campbellii、哈氏弧菌V.harveyi和新喀里多尼亞弧菌V.neocaledonicus。其中哈氏弧菌是水產養殖動物的重要條件致病菌，常常能夠導致水產動物在養殖過程中大量死亡[42]。研究發現，弧菌是扇貝幼體的主要致病菌[41]，Liu 等[35]從患病蝦夷扇貝中分離出燦爛弧菌，感染實驗證明此菌能使蝦夷扇貝幼體大量死亡。

希瓦氏菌屬和鹽單胞菌屬是腸道樣品的特異性細菌，希瓦氏菌屬在很多水生動物體內均有發現，該菌屬對不同魚蝦的致病菌，如副溶血弧菌和哈維弧菌具有拮抗活性[43-44]。馬氏珠母貝腸道特有菌的來源及希瓦氏菌屬對腸道致病菌是否具有拮抗活性等還有待進一步研究。

本研究共獲得馬氏珠母貝腸道可培養細菌25種，隸屬于2 個門、2 個綱、4 個目、5 個科和6 個屬。課題組前期利用高通量測序研究發現馬氏珠母貝腸道內共有932 種細菌，隸屬于26 個門、53 個綱、83 目、143 個科和219 個屬[22]。研究方法的顯著差異是造成研究結果不完全一致的主要原因。基于高通量測序的宏基因組分析能獲得樣品中全部細菌基因組信息，進而還能對細菌群落結構及其代謝功能進行分析；基于分離培養技術開展菌群分析僅能獲得可培養細菌的信息，但可以從中篩選、純化專性益生菌，為開發生態健康養殖技術積累基礎資料。

4 結論

馬氏珠母貝腸道及其養殖海區水體可培養細菌均隸屬于變形菌門和厚壁菌門，但門以下階元尤其是屬、種水平差異明顯。馬氏珠母貝腸道中的芽孢桿菌屬、弧菌屬和假交替單胞菌屬的菌株具有作為益生菌開發應用的潛力。