雙熒光素酶報告基因系統驗證hsa-miR-1291對ARHGAP29基因的調控作用

徐 倩 汪 沙 劉麒薇 呂承曉 甘 露 柳 鑫

(首都醫科大學附屬北京婦產醫院婦科微創中心，北京 100006)

微小RNA (microRNA, miR)是重要的內源性短鏈非編碼RNA分子，通過對其相應靶基因的負性調節，下調靶基因的表達，從而影響靶基因相關的各種生物學調控機制[1-2]。Rho家族小GTP酶(RhoGTP酶)是細胞表面受體同肌動蛋白細胞骨架的信號橋梁，而Rho GTP酶活化蛋白29 (Rho GTPase activating protein 29，ArhGAP29)可以調節RhoGTP酶活性，影響細胞黏附、細胞-細胞外基質黏附以及肌動蛋白重排[3-5]。研究[5]顯示，hsa-miR-1291在宮腔粘連內膜組織中出現異常上調，通過構建差異microRNA與負相關基因的調控網絡模式圖，預測ARHGAP29為其潛在靶基因。ARHGAP29基因定位于人類染色體1p22.1，基因轉錄本長度為8 952 bp，編碼蛋白大小為1 261個氨基酸。本研究擬采用雙熒光素酶報告基因系統，進一步驗證hsa-miR-1291能否對預測靶基因ARHGAP29產生靶向調控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

ARHGAP29目的基因序列及突變序列由廣州市銳博生物科技有限公司合成，293T細胞系購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，蛋白胨、酵母提取物(英國OXOID公司)，限制性內切酶(XhoI, NotI)、連接反應液、DNA聚合酶(美國Thermo公司)，質粒小提試劑盒、DNA純化回收試劑盒、DH5α感受態細胞(北京天根生化科技有限公司)，2×Kofu Mix(廣州市銳博生物科技有限公司)，氨芐西林(美國Sigma公司)，DMEM培養基、胰酶(美國GIBCO公司)，Lipo6000TM轉染試劑(碧云天公司)，pmiR-RB-ReportTMh-ARHGAP29(NM_004815.43′UTR: 61-945)-WT(h-ARHGAP29-WT)、pmiR-RB-ReportTMh-ARHGAP29(NM_004815.43′UTR: 61-945)-MUT(81-87: CAGGGCC>GTCCCGG)(h-ARHGAP29-MUT)、micrON?hsa-miR-1291mimic and micrON?miRNA mimic NC(廣州市銳博生物科技有限公司)、Dual-Glo?熒光素酶檢測系統(美國Promega公司)、LUMITRACTM200 96孔白色細胞培養板、GLOMAX 96 分光光度計(美國Promega公司)，PCR儀(美國Bio-RAD公司)，離心機(湖南湘儀實驗儀器開發有限公司)，恒溫振蕩器(上海精宏實驗設備有限公司)，培養箱(上海一恒科技有限公司)，生物潔凈工作臺(蘇凈安泰空氣技術有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 生物學位點預測

利用生物學靶基因預測軟件Targetscan(www. targetscan.org)對 hsa-miR-1291與預測靶基因ARHGAP29的3′非編碼區(3′ untranslated region，3′UTR)位點進行分析，得到分析結合位點。

1.2.2 雙熒光素酶報告基因載體的構建

序列合成：分別化學合成ARHGAP29基因野生型序列及突變型序列，并在序列兩端添加XhoI、NotI酶切位點。PCR擴增及純化：合成序列克隆至pmiR-RB-ReportTM載體骨架中，PCR擴增產物進行1.5%瓊脂糖電泳分析,引物序列見表1。純化PCR產物。酶切：用XhoI、NotI對純化產物和載體進行雙酶切，回收純化酶切產物。連接：連接目的片段與pmiR-RB-ReportTM載體骨架。轉化：取連接產物加到100 μL DH5α感受態細胞中混勻，冰浴30 min，42 ℃水浴90 s，取出后立即置于冰浴中放置2～3 min，向其中加入900 μL 37 ℃預熱的LB(不含抗生素)培養基，150 r/min、37 ℃振蕩培養45 min。吸走上清液，100 μL 混勻菌液，加到含Amp抗生素LB固體瓊脂培養基上(抗生素濃度100 μg/mL)，將平板倒置，37 ℃培養12～16 h。 菌落鑒定及測序：挑取上述平板上的單菌落，溶到3 μL水中，取0.5 μL做模板，進行PCR。提取質粒，陽性克隆進行測序鑒定。

表1 雙熒光素酶報告基因載體引物序列Tab.1 Primer sequence of the Dual Luciferase Reporter

1.2.3 細胞轉染

接種：取對數生長期的293T細胞，接種于96孔板中，每孔1.5×104個細胞，每孔總體積100 μL，于37 ℃ 培養箱中培養24 h。 混合：采用OPTI-MEM培養基分別稀釋hsa-miR-1291 mimic及NC、野生型載體ARHGAP29-WT 3′UTR pmiR-RB-Report及突變型載體ARHGAP29-MUT 3′UTR pmiR-RB-Report、LipofectamineTM2000試劑，靜置20 min。轉染：取50 μL混合液分別共轉染于含50 μL培養基的293T細胞中，共分為4組：h-ARHGAP29-WT+hsa-miR-1291組、h-ARHGAP29-WT+NC組、h-ARHGAP29-MUT+hsa-miR-1291組、h-ARHGAP29-MUT+陰性對照(non-target control,NC)組，每組設3個復孔(n=3)，最終每孔總體積100 μL。6 h后再加100 μL新鮮培養基。

1.2.4 熒光素酶活性測定

轉染48 h后吸出培養基， 以35 μL/孔加入1× PBS，每孔加入35 μL Luciferase底物與Luciferase buffer混合液，振蕩10 min，轉移至LUMITRACTM200 96孔白色細胞培養板中，分光光度計測定熒光值。加入30 μL中止液，振蕩10 min，分光光度計測定熒光值。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 載體骨架的構建

選擇海腎熒光素酶基因(hRluc)為報告熒光，螢火蟲熒光素酶基因(hluc)為校正熒光，構建3′UTR雙熒光素酶載體骨架，骨架大小為6.3 kb，詳見圖1。

圖1 雙熒光素酶載體骨架(pmiR-RB-ReportTM)Fig.1 Vector frame of dual luciferase reporter system (pmiR-RB-ReportTM)hRluc:renilla luciferase; hluc: firefly luciferase.

2.2 測序分析

對含有has-miR-1291基因結合位點的野生型序列及缺失has-miR-1291基因結合位點的突變型序列進行克隆測序，h-ARHGAP29(NM_004815.4 3′UTR: 61-945)-WT野生型包含：(81-87) CAGGGCC；h-ARHGAP29(NM_004815.4 3′UTR: 61-945)-MUT(81-87 CAGGGCC>GTCCCGG)，野生型載體及突變型載體均構建成功，可用于后續靶點驗證實驗(圖2、3)。

圖2 熒光素酶報告載體 h-ARHGAP29-WT測序圖Fig.2 Sequence diagram of luciferase reporter vector h-ARHGAP29-WT

圖3 熒光素酶報告載體h-ARHGAP29-MUT測序圖(突變靶點序列81-87 CAGGGCC-GTCCCGG)Fig.3 Sequence diagram of luciferase reporter vector h-ARHGAP29-MUT (mutant target sequence 81-87 CAGGGCC-GTCCCGG)

2.3 熒光素酶活性分析

將hsa-miR-1291 mimic及NC分別同野生型載體共轉染至工具細胞293T細胞，即h-ARHGAP29-WT+hsa-miR-1291組、h-ARHGAP29-WT+NC組，檢測其相對熒光值分別為0.67±0.04及1.00±0.08。將hsa-miR-1291 mimic及NC分別同突變型載體共轉染至工具細胞293T細胞，即h-ARHGAP29-MUT+hsa-miR-1291組、h-ARHGAP29-MUT+NC組，檢測其相對熒光值為1.20±0.05及1.00±0.10。對各組熒光素酶檢測結果分析顯示，野生型載體轉染hsa-miR-1291 mimic后，其熒光表達較NC組明顯下降(0.67±0.04vs1.00±0.08，P=0.014)；轉染hsa-miR-1291 mimic后，突變型載體的熒光表達相對于野生型載體的熒光表達有所上升(1.20±0.05vs0.67±0.04,P<0.001),詳見圖4。

圖4 相對熒光值表達(n=3)Fig.4 Relative fluorescence expression of different vector groups(n=3)*P<0.05 vs h-ARHGAP29-WT+NC group， ***P<0.001 vs h-ARHGAP29-WT+ hsa-miR-1291 group. NC:non-target control.

3 討論

MicroRNA是長度為20～22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，能夠通過互補序列和3′ UTR之間的核苷酸堿基配對在轉錄后水平抑制基因表達[1]。本研究組前期使用基因芯片技術，對宮腔粘連患者子宮內膜和非宮腔粘連患者子宮內膜組織中hsa-miR的差異表達進行檢測，發現在宮腔粘連患者的子宮內膜中hsa-miR-1291水平顯著升高[6]。研究[7-8]顯示， miR-1291可具有多種功能，包括調節細胞藥物反應及化學敏感性，以及通過特定靶基因來調節細胞增生和代謝。

通過GO分析、miRDB數據庫及Targetscan軟件，筆者預測ARHGAP29為hsa-miR-1291的負性調節靶基因。ArhGAP29是抑制Rho信號傳導途徑的特定類型RhoGTP酶活化蛋白，具有RhoA的GAP結構域，同RhoA具有很強的親和力，是RhoA的關鍵調節因子，可使RhoA由三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate，GTP)限制型轉變為二磷酸鳥苷(guanosine diphosphate，GDP)限制型而失活，進一步影響下游效應分子，其對細胞骨架及細胞遷移、侵襲的影響已在多種疾病細胞系中得以證實[9-10]。

RhoA是小G蛋白超家族中的一個成員，具有GTP酶活性，是細胞表面受體同胞內多種信號蛋白的中介，參與多種信號通路調控，其中，Rho相關蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil containing protein kinases，RhoA/ROCK)信號通路涉及多種纖維化疾病的調控，在肺、腎、心血管和肝臟纖維病變中被廣泛研究[11-13]。目前研究[14]顯示，宮腔粘連的重要病變機制為子宮內膜纖維化改變，筆者推測，ArhGAP29的降低可能導致RhoA被激活，影響下游效應分子ROCK，調節細胞動力學和肌動蛋白細胞骨架，進而影響細胞分裂及細胞周期，改變上皮細胞極性的穩定性，參與子宮內膜纖維化過程的調控。ArhGAP29可以通過同相關蛋白結合，蛋白移位以及多聚體的形成等方式，抑制Rho信號通路，促進應力纖維形成，增強內皮細胞的屏障功能，改變細胞骨架結構[15-16]，這可能是ArhGAP29 在纖維化過程中發揮作用的機制之一。ArhGAP29作為分子開關在胞內信號轉導以及肌動蛋白細胞骨架調控中發揮重要橋梁作用，因此有可能成為子宮內膜纖維化的調節靶點之一。

宮腔粘連內膜病變中hsa-miR-1291及其預測靶基因ARHGAP29的發現，為闡明宮腔粘連子宮內膜纖維化打開了新的視角。本研究確定了hsa-miR-1291同ARHGAP29基因的靶向調控關系，為進一步研究其在子宮內膜纖維化病變機制中的作用奠定了基礎。MiR-1291是否有可能成為宮腔粘連的分子標志物，其靶基因ARHGAP29能否成為宮腔粘連的治療靶點，通過調節肌動蛋白細胞骨架重構及改變細胞遷移能力，逆轉和阻斷子宮內膜纖維化病變的發展，值得進一步深入研究。