阿司匹林聯(lián)合長春瑞濱對人乳腺癌細胞MCF-7的作用機制研究

邊 靜，張彭輝，李佳佳(河南科技大學第一附屬醫(yī)院第二藥房，洛陽 471300)

長春瑞濱(VNR)是一種新型的半合成長春堿類抗癌藥[1]，主要作用于腫瘤細胞G2期，屬細胞周期特異性藥物[2]，可阻滯微管蛋白聚合并促進誘導微管的解聚，使腫瘤細胞在有絲分裂中受阻，導致分裂增殖停止于有絲分裂中期。研究表明，使用其他藥物聯(lián)合VNR治療乳腺癌效果較好[3]。張旭等[4]研究表明，環(huán)氧合酶-2 (COX-2)在結腸癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌和乳腺癌等多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達，說明COX-2參與了多種癌癥的發(fā)生與發(fā)展。呂田等[5]研究表明，非甾體抗炎藥物可通過抑制 COX-2 發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛等作用，本文旨在研究阿司匹林聯(lián)合VNR對人乳腺癌細胞MCF-7的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 人乳腺癌細胞MCF-7，購自中國科學院細胞庫。

1.2試藥 RPMI 1640型培養(yǎng)基(批號20181219)，武漢純度生物科技有限公司；Annexin V-FITC和PI凋亡檢測試劑盒(批號20190113)，艾美捷科技有限公司；B細胞淋巴瘤/白血病-2抗體(Bcl-2，批號2019001)，Bcl相關X蛋白抗體(Bax，批號20181203)，磷酸化絲氨酸蘇氨酸激酶抗體(P-Akt，批號20190103)，絲氨酸蘇氨酸激酶抗體(Akt，批號20190103)，半胱氨酸蛋白酶3抗體(Caspase-3，批號20190106)，半胱氨酸蛋白酶9抗體(Caspase-9，批號20190105)，均購自Santa Cruz Animal Health公司；阿司匹林(國藥準字：J20171021)，購自阿斯利康制藥有限公司；VNR(批號20190110)，購自上海源葉生物科技有限公司；二甲基亞砜(批號20190122)，購自上海研卉生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1細胞培養(yǎng) 將MCF-7細胞培養(yǎng)于RPMI 1640 培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫箱中，調(diào)整二氧化碳濃度至2.23×105mol·L-1，取處于對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.3.2分組及給藥 本實驗分為4組：空白對照組(添加等量的細胞培養(yǎng)液)，VNR組(VNR 10 μg·mL-1給藥治療)，阿司匹林+VNR低劑量組(阿司匹林5 mmol·L-1和VNR 10 μg·mL-1聯(lián)合治療)，阿司匹林+VNR高劑量組(阿司匹林10 mmol·L-1和VNR 10 μg·mL-1聯(lián)合治療)[6-7]。

1.3.3MTT法檢測細胞的增殖情況 取處于對數(shù)生長期的MCF-7細胞，以細胞密度1×107個·L-1接種于96孔板內(nèi)，分別向3個給藥組加入對應藥物進行治療。培養(yǎng)4 h，棄去上清液，加二甲基亞砜100 μL，振蕩待其充分溶解后，于24和48 h分別在490 nm波長處用酶標儀測定其吸光度值A，并計算細胞生長抑制率。

1.3.4流式細胞儀檢測細胞凋亡及周期變化 分別使用4組相關藥物處理處于對數(shù)生長期的MCF-7細胞，消化后恒溫離心 5 min，加入 Binding Buffer 重懸細胞100 μL，并加入 Annexin V-FITC和PI各5 μL，混勻；孵育后加入 Binding Buffer 400 μL，用流式細胞儀檢測。

1.3.5Western Blot法檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、P-Akt和Akt蛋白表達 采用蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，用Bradford調(diào)整各組蛋白濃度使一致，再經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，密封2 h，加入Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、P-Akt和Akt抗體(1∶500)于4 ℃ 孵育過夜，加入HRP標記二抗(1∶500)孵育1 h，顯色，曝光后以β-actin為內(nèi)參蛋白，蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值÷內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.4統(tǒng)計學方法 本研究數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0，使用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，本研究所有檢驗均為雙側(cè)檢驗。

2 結果

2.1MTT觀察細胞的增殖情況 見表1。由表1可知，與空白對照組比較，VNR組MCF-7細胞在24，48 h抑制率均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與VNR組比較，阿司匹林+VNR低劑量組MCF-7細胞在24，48 h抑制率顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與阿司匹林+VNR低劑量組比較，阿司匹林+VNR高劑量組MCF-7細胞在24，48 h抑制率均有一定程度升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 細胞的增殖情況觀察

2.2流式細胞術檢驗細胞凋亡率和細胞周期分布情況 見圖1、圖2和表2。由圖1可知，空白對照組細胞凋亡率較低；與空白對照組比較，VNR組MCF-7的細胞凋亡率有一定程度升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與VNR組比較，阿司匹林+VNR低劑量組MCF-7細胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與阿司匹林+VNR低劑量組比較，阿司匹林+VNR高劑量組MCF-7細胞凋亡率有一定程度升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

由表2和圖2可知，空白對照組細胞各周期數(shù)量均正常；與空白對照組比較，VNR組MCF-7細胞G1期細胞減少，S期細胞增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，G2期細胞無顯著變化(P>0.05)；與VNR組比較，阿司匹林+VNR低劑量組MCF-7細胞G1期顯著減少，S期細胞顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，G2期細胞無顯著變化(P>0.05)；與阿司匹林+VNR低劑量組比較，阿司匹林+VNR高劑量組MCF-7 細胞G1期減少，S期增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，G2期無顯著變化(P>0.05)。

圖1 流式細胞凋亡觀察結果

圖2 流式細胞凋亡周期觀察結果

表2 聯(lián)合用藥對MCF-7細胞周期的影響

2.3相關凋亡蛋白檢測 見表3和圖3。由表3和圖3可知，與空白對照組比較，VNR組Bcl-2蛋白表達量顯著下降，Bax蛋白表達量顯著升高(P<0.01)；與VNR組比較，阿司匹林+VNR低劑量組Bcl-2蛋白表達量顯著下降，Bax蛋白表達量顯著升高(P<0.01)；與阿司匹林+VNR低劑量組比較，阿司匹林+VNR高劑量組Bcl-2蛋白表達有一定程度下降，Bax蛋白表達量有一定程度升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表3 凋亡Bcl-2和Bax蛋白表達情況

圖3 聯(lián)合給藥對相關凋亡蛋白的影響

2.4Caspase家族相關蛋白檢測 見表4和圖4。由表4和圖4可知，與空白對照組比較，VNR組Caspase-3和Caspase-9蛋白表達量顯著升高(P<0.01)；與VNR組比較，阿司匹林+VNR低劑量組Caspase-3和Caspase-9蛋白表達量顯著升高(P<0.01)；與阿司匹林+VNR低劑量組比較，阿司匹林+VNR高劑量組Caspase-3和Caspase-9蛋白表達量有一定程度升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表4 凋亡Caspase-3和Caspase-9蛋白表達情況

圖4 聯(lián)合給藥對Caspase家族蛋白的影響

2.5磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸蘇氨酸激酶(PI3K/Akt)信號通路相關蛋白的影響 見表5和圖5。由表5和圖5可知，與空白對照組比較，VNR組P-Akt蛋白表達量有一定程度下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，Akt蛋白表達量無顯著變化(P>0.05)；與VNR組比較，阿司匹林+VNR低劑量組P-Akt蛋白表達量顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，Akt蛋白表達量無顯著變化(P>0.05)；與阿司匹林+VNR低劑量組比較，阿司匹林+VNR高劑量組P-Akt蛋白表達量顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，Akt蛋白表達量無顯著變化(P>0.05)。

表5 凋亡P-Akt和Akt蛋白表達情況

圖5 聯(lián)合給藥對PI3K/Akt信號通路相關蛋白的影響

3 討論

翁熊等[8]研究表明，腫瘤細胞周期停止于有絲分裂前期，能避免腫瘤細胞不斷進入有絲分裂期，從而抑制其進一步發(fā)展，調(diào)節(jié)細胞周期可作為腫瘤治療的一種重要方法。白宏等[9]研究表明，細胞周期可分為G1期、S期、G2期和M期4個時期，是高度有序的運轉(zhuǎn)過程，只有在完成上一個時相后才能進入下一個時相。細胞完成每一個時相時會把不同染色體準確無誤地遺傳給子代細胞。這一過程中，每個誤差都可能導致遺傳信息的改變，從而導致腫瘤或其他疾病的發(fā)生。岳慶喜等[10]研究表明，許多抗腫瘤藥物直接參與對細胞周期調(diào)控蛋白的表達調(diào)控，同時細胞增殖周期的檢測是抗腫瘤作用及其機制研究的常用生物學指標。王茜等[11]研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥和單獨給藥均能抑制MCF-7細胞，使細胞阻滯在S期并抑制Akt的磷酸化。有研究發(fā)現(xiàn)[12]，使用流式細胞術檢測阿司匹林可使MCF-7細胞阻滯于G2/M期和S期。本實驗結果表明，阿司匹林聯(lián)合VNR使得乳腺癌細胞的S期細胞百分比顯著增高，說明聯(lián)合用藥可將MCF-7細胞抑制在S期，防止腫瘤細胞進入有絲分裂期從而抑制其進一步發(fā)展，這與吳穎等[13]的研究結論一致。

細胞凋亡受多種基因共同調(diào)控[14]，Caspase是重要的調(diào)控基因之一，Caspase-3和Caspase-9是Caspase家族中主要的凋亡因子[15]。Caspase-9是Caspase家族的凋亡啟動子，可產(chǎn)生有活性的凋亡執(zhí)行基因Caspase-3并剪切Caspase 底物引起級聯(lián)反應促進細胞的凋亡[16]。研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-3和Caspase-9表達顯著升高，說明阿司匹林聯(lián)合VNR作用后促進了Caspase-9和Caspase-3的蛋白表達，使得細胞凋亡啟動、執(zhí)行和發(fā)展均受到促進。阿司匹林聯(lián)合VNR使得Caspase-9表達增加，細胞凋亡子啟動，促進Caspase-9裂解，使得非活化狀態(tài)Caspase-3 產(chǎn)生有活性的 Caspase-3，其含量也增加，最終促進人乳腺癌細胞MCF-7的凋亡，這與吳娟等[17]的研究結論一致。Bcl-2 家族和Caspase家族作用類似，也可調(diào)控細胞的凋亡，在Bcl-2 家族中，當Bcl-2蛋白表達下降時，Bax蛋白表達上升，此時細胞趨于凋亡，相反，Bcl-2蛋白表達升高時Bax蛋白表達則會下降，細胞的凋亡同時也會受到抑制[18-20]。本實驗結果表明，Bax蛋白表達顯著升高，Bcl-2蛋白表達顯著降低，說明阿司匹林聯(lián)合VNR可有效促進MCF-7細胞凋亡，達到抑制乳腺癌發(fā)展的效果。

Fang W L等[21]研究表明，在癌細胞中PI3K/Akt信號通路被異常激活，其作用機制主要是PI3K催化亞單位α(PIK3CA)基因突變以及10號染色體丟失磷酸酶基因(PTEN)表達的丟失等。因此，PI3K/Akt信號通路在乳腺癌的治療中起著十分重要的作用。目前以這條通路為作用靶點的抑制劑已成為研究熱點。已知的通路抑制劑包括PI3K抑制劑、PI3K/Akt雙重抑制劑和Akt抑制劑。研究顯示，阿司匹林聯(lián)合VNR能顯著降低Akt的磷酸化，但總量改變并不顯著，說明阿司匹林聯(lián)合VNR促進癌細胞凋亡是通過抑制 PI3K/Akt 信號通路發(fā)揮效應，減少Akt的磷酸化，促進人甲狀腺癌細胞(IHH4)的凋亡。

綜上所述，阿司匹林聯(lián)合VNR可通過抑制PI3K/Akt信號通路有效誘導MCF-7細胞凋亡，其作用機制既與調(diào)控Caspase家族和Bcl-2家族基因相關，也與抑制PI3K/Akt信號通路有關。VNR可聯(lián)合使用的藥物較多，在后續(xù)的實驗中可進一步探討其他藥物聯(lián)合VNR對MCF-7細胞的作用機制。