載10-羥基喜樹堿靶向相變納米粒聯(lián)合高強(qiáng)度聚焦超聲治療裸鼠肝癌移植瘤

任春蓉 張戰(zhàn)峰 陳春燕 魏小芳 周 洋

高強(qiáng)度聚焦超聲（high intensity focused ultrasound，HIFU）作為最具代表性的非侵入性治療腫瘤的方式之一，應(yīng)用前景廣泛，但其治療深部腫瘤（如肝癌）時(shí)需增加超聲功率或延長(zhǎng)單次消融時(shí)間，且其療效和生物安全性降低，嚴(yán)重阻礙了其在臨床的進(jìn)一步發(fā)展應(yīng)用［1］。相關(guān)研究［2-3］應(yīng)用超聲增效劑改變組織的聲環(huán)境、增加超聲空化作用和能量沉積來增效HIFU 治療。其中相變超聲造影劑通過靜脈注射后再行HIFU 輻照，可在腫瘤原位相變產(chǎn)生微泡，增效HIFU 的同時(shí)監(jiān)控HIFU消融過程，取得了較好的效果。然而，HIFU消融不可避免存在殘余腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，同時(shí)因HIFU 消融可破壞腫瘤血管致化療藥物難以到達(dá)腫瘤［4-5］。本實(shí)驗(yàn)擬制備一種葉酸受體靶向的載10-羥基喜樹堿相變納米粒（folic acid receptortargeted 10-hydroxycamptothecin -loaded phase-change nanoparticle contrast agent，F(xiàn)R-HCPT-PNPCA），可以在增效HIFU 消融的同時(shí)釋放化療藥物，旨在更好地殺滅腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)遠(yuǎn)期療效，為腫瘤精準(zhǔn)治療提供一種新的手段。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c 裸鼠 160 只，3～5 周齡，平均體質(zhì)量（20.1±2.2）g，購(gòu)于西南交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均取得西南交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)同意。

二、儀器與試劑

1.主要試劑和細(xì)胞：磷脂酰膽堿（DPPC）、偶聯(lián)葉酸的磷脂酰乙醇胺［DSPE（PEG）Folate］、普通磷脂酰乙醇胺（DSPE）、甘油磷脂（DPPG）、泊洛沙姆（PF68）及膽固醇（CH）購(gòu)于美國(guó)Avanti 公司，全氟己烷（PFH）購(gòu)于法國(guó)Elf Atochem 公司，末端標(biāo)記測(cè)定法（TUNEL法）檢測(cè)細(xì)胞凋亡和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）抗體購(gòu)于美國(guó) Sigma 公司，10-HCPT、三氯甲烷、甲醛及 TTC 染色試劑購(gòu)于生工生物工程（上海）有限公司。人肝癌7721 細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。

2.實(shí)驗(yàn)儀器：78-1 磁力攪拌器（上海越磁電子科技有限公司），RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），F(xiàn)J-200 高速分散均質(zhì)機(jī)（上海隆拓儀器有限公司），VCX-130 超聲破碎儀（美國(guó)SONIC 公司），倒置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司），MyLab 90 彩色多普勒超聲診斷儀（意大利百勝醫(yī)療），JC-A HIFU 治療儀（重慶海扶醫(yī)療科技股份有限公司）。

三、FR-HCPT-PNPCA 的制備

HIFU 消融前 1 d 參照本課題組前期研究［6-7］的方法，將殼材［DPPC、DSPE（PEG）Folate/DSPE、DPPG、PF68、CH 和10-HCPT］按5∶1∶1∶1∶1∶1 的比例用三氯甲烷、甲醛溶解，加入后真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，重新水化后加入PFH 經(jīng)過雙步乳化制得乳白色的FR-HCPTPNPCA 乳劑。不加入10-HCPT 則制得單純靶向非載藥相變納米粒（FR-PNPCA）乳劑，成品送西南交通大學(xué)材料學(xué)院測(cè)得乳劑平均粒徑（340±45）nm，濃度1.12×1010個(gè)/ml。

四、荷瘤裸鼠模型建立及分組

1.荷瘤裸鼠模型建立及分組：選取160 只BALB/c裸鼠，采用皮下注射人肝癌7721細(xì)胞的方法建立荷瘤裸鼠模型，3～4 周后選取腫瘤大小約1 cm×1 cm×1 cm荷瘤裸鼠120 只，隨機(jī)等分為4 組，于HIFU 治療前1 d分別通過尾靜脈注射藥物或生理鹽水200 μl。A 組為注射生理鹽水后行HIFU 輻照，B 組為注射HCPT（2 mg/ml）后行 HIFU 輻照，C 組為注射 FR-PNPCA 后行 HIFU 輻 照 ，D 組 為 注 射 FR-HCPT-PNPCA 后 行HIFU輻照。

2.HIFU 治療：參照既往實(shí)驗(yàn)研究［2-3］方法，裸鼠腹腔內(nèi)注射1%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉，固定四肢，將腫瘤部位完全浸入HIFU 治療儀的脫氣水槽中，超聲確定焦域位于腫瘤中心，采用點(diǎn)輻照的方式進(jìn)行消融治療，能量為120 W，作用時(shí)間5 s。

五、觀察指標(biāo)

1.HIFU 輻照后即刻應(yīng)用超聲（LS 22 探頭，頻率3～7 MHz）觀察各組腫瘤內(nèi)灰度變化，手動(dòng)勾畫出變化明顯區(qū)域，儀器自動(dòng)計(jì)算灰度變化值和灰度變化面積。

2.輻照后2 h 觀察大體病理和藥物濃度。每組均處死10 只裸鼠，取腫瘤組織行TTC 染色先肉眼觀察，后組織切片行HE 染色于顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞壞死情況。然后腫瘤組織作組織勻漿，高效液相色譜檢測(cè)各組瘤內(nèi)HCPT濃度。

3.輻照后48 h 行免疫組化檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡情況。每組再處死10 只裸鼠，取腫瘤組織切片行PCNA 和TUNEL 染色。顯微鏡下人工計(jì)數(shù)視野下染棕黃色細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞增殖率和凋亡率。

4.輻照后2 周觀察腫瘤的生長(zhǎng)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況。處死各組剩余裸鼠，測(cè)量腫瘤大小，并取主要臟器觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件，正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，各組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較行LSD 法；非正態(tài)分布的計(jì)量資料比較行Mann-WhitneyU秩和檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組腫瘤灰度變化比較

HIFU輻照后即刻，超聲示A、B組輻照區(qū)域幾乎無灰度變化，C、D組均見明顯灰度變化，其灰度變化面積和變化值與A、B組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；C、D組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1和表1。

二、各組瘤內(nèi)藥物濃度比較

圖1 各組裸鼠腫瘤HIFU輻照前后超聲圖像

表1 各組腫瘤觀察指標(biāo)比較（）

表1 各組腫瘤觀察指標(biāo)比較（）

與A組比較，#P＜0.05；與B組比較，△P＜0.05；與C組比較，*P＜0.05

組別A組B組C組D組轉(zhuǎn)移灶數(shù)量（個(gè)）12.51±3.25 10.87±3.43 4.42±2.27 3.14±1.66#*△灰度變化面積（mm2）5.43±2.28 5.68±2.45*113.52±14.17#115.43±13.73#灰度變化值（IU）7.23±3.79 7.96±4.04*74.49±17.15#73.77±16.94#凝固性壞死體積（mm3）0 0*258.88±28.21#263.74±32.86#細(xì)胞增殖率（%）63.77±11.43 64.58±10.76*46.44±7.82#37.49±6.97#*細(xì)胞凋亡率（%）8.31±2.45 8.79±2.77*36.39±5.15#51.06±8.73#*腫瘤體積（mm3）1.75±0.38 1.48±0.45*0.65±0.22#0.31±0.14#*

A、C組腫瘤組織勻漿內(nèi)均未測(cè)得HCPT，B、D組測(cè)得HCPT濃度分別為（0.50±0.14）mg/ml、（1.20±0.42）mg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

三、病理結(jié)果比較

1.大體病理：輻照后2 h，A、B 組腫瘤內(nèi)均無明顯凝固性壞死，呈均勻紅色；C、D組腫瘤內(nèi)均可見明顯凝固性壞死，邊界清楚，呈灰白色，C、D 組壞死范圍與A、B組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。輻照后2周，A、B 組腫瘤體積均明顯增大，與C、D 組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。各組均見不同部位（肝、腹腔、肺、腦）的腫瘤轉(zhuǎn)移，A、B、C、D 組轉(zhuǎn)移灶數(shù)量分別為（12.51±3.25）個(gè)、（10.87±3.43）個(gè)、（4.42±2.27）個(gè)、（3.14±1.66）個(gè)，D 組與A、B、C 組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表1和圖2。

2.組織病理：輻照后2 h，病理示C、D 組靶區(qū)細(xì)胞大片壞死，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，呈不規(guī)則紅色，與未壞死的腫瘤細(xì)胞邊界清楚。輻照后24 h，免疫組化示D 組增殖率最低，凋亡率最高，與A、B、C 組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1和圖3。

圖2 各組裸鼠腫瘤HIFU輻照后大體圖

圖3 裸鼠腫瘤HIFU消融后病理圖（×400）

討 論

HIFU通過聚焦超聲能量來消融和破壞腫瘤組織，已應(yīng)用于臨床原發(fā)性實(shí)體瘤及轉(zhuǎn)移性腫瘤的治療。然而，在面對(duì)位置較深、體積較大的腫瘤（如肝癌、胰腺癌等）時(shí)，由于沿超聲途徑的能量快速衰減，治療效果欠佳，限制了其臨床應(yīng)用。研究［3］證實(shí)微泡可以改變組織的聲環(huán)境，通過增加超聲空化作用可增強(qiáng)HIFU消融的效果，但其受微泡不穩(wěn)定、循環(huán)時(shí)間短、粒徑大等因素影響，尤其作為血池顯影劑，其在增效HIFU 的同時(shí)可能導(dǎo)致能量在焦域近場(chǎng)沉積，甚至因壞死區(qū)變形成為近大遠(yuǎn)小的“蝌蚪形”，從而導(dǎo)致消融灶不可控，可能存在焦點(diǎn)前加熱和周圍組織損傷。在此背景下，基于各種納米系統(tǒng)的相變超聲造影劑應(yīng)運(yùn)而生［1-4］，廣泛應(yīng)用于HIFU增效。經(jīng)靜脈注射后，相變?cè)煊皠┝阶阋酝ㄟ^血管內(nèi)皮間隙在腫瘤組織內(nèi)存留，在HIFU 能量作用下，其可在靶區(qū)原位產(chǎn)生微泡，增加HIFU 能量沉積，降低HIFU 作用功率、縮短治療時(shí)間、增加消融范圍，最終達(dá)到增強(qiáng)HIFU 治療效果，且此“從小到大、原位相變”的策略還有利于避免微泡增效HIFU 引起焦點(diǎn)外損傷的缺陷［1，3］。本實(shí)驗(yàn)所用 HIFU能量為120 W，作用時(shí)間為5 s，這一能量不足以消融腫瘤，故A、B 組輻照后腫瘤并無灰度變化和細(xì)胞凝固性壞死，而注射了靶向相變?cè)煊皠┑腃、D 組輻照后均提示腫瘤灰度變化和細(xì)胞凝固性壞死。

為了增加相變納米粒在腫瘤細(xì)胞周圍的蓄積以增效HIFU，包載具有主動(dòng)靶向能力的葉酸受體相變納米粒是可供選擇的方式之一。本課題組前期研究［6-7］中制備了包載10-HCPT 的葉酸受體靶向相變?cè)煊皠⒆C實(shí)其能夠較好地黏附在腫瘤細(xì)胞周圍。本課題組另一研究［3］也發(fā)現(xiàn)葉酸受體靶向的相變?cè)煊皠┛稍谀[瘤內(nèi)靶向沉積，與非靶向的相變?cè)煊皠┫啾龋琀IFU消融后腫瘤壞死范圍增大，腫瘤細(xì)胞增殖率降低而凋亡率升高。但無論采取何種增效方式，HIFU消融后腫瘤殘余、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移均是難以避免的問題［2，8-9］。

本實(shí)驗(yàn)制備的靶向載藥相變納米粒FR-HCPTPNPCA，將基于超聲靶向破壞微泡技術(shù)［10］的腫瘤靶向給藥系統(tǒng)融入HIFU 消融和增效中，結(jié)果顯示，D 組腫瘤內(nèi)FR-HCPT-PNPCA 沉積，在HIFU 輻照后可破壞微泡定向釋放HCPT，不僅消融范圍擴(kuò)大、腫瘤細(xì)胞增殖率最低、凋亡率最高，且腫瘤生長(zhǎng)緩慢、轉(zhuǎn)移灶最少，由此可見該方法對(duì)腫瘤的遠(yuǎn)期療效最好。A 組為生理鹽水+HIFU 輻照，既往研究［3］表明，低劑量 HIFU輻照不足以引起腫瘤細(xì)胞明顯壞死。B 組為注射HCPT+HIFU 輻照，治療效果欠佳，C 組 HIFU 輻照后即刻腫瘤灰度變化和壞死體積與D組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但輻照2 周后療效低于D 組（P＜0.05）。究其原因可能為：①HIFU 能量低，HCPT 溶液不能增效HIFU；②注射的HCPT 單體容易通過代謝清除，可能降低抑瘤效果；③靶向相變?cè)煊皠┯欣谠黾親IFU能量在靶區(qū)沉積，故輻照后短時(shí)間內(nèi)C、D 組效果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)中D 組的腫瘤組織HCPT 濃度高于B 組（P＜0.05），原因?yàn)榧{米材料在腫瘤蓄積，在HIFU 作用下，既發(fā)生了相變（靶區(qū)灰度變化證實(shí)），又破壞相變微泡釋放HCPT（瘤內(nèi)藥物濃度證實(shí)），達(dá)到了超聲靶向破壞微泡聯(lián)合腫瘤靶向給藥的作用，C、D 組間腫瘤細(xì)胞增殖率和凋亡率的差異也能解釋兩組間遠(yuǎn)期療效的差異，但其相關(guān)機(jī)制和最佳釋放藥物條件（如持續(xù)輻照或者間歇輻照、輻照時(shí)間的優(yōu)化等）有待今后進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)的局限性：僅在既往研究［3］結(jié)果證實(shí)的基礎(chǔ)上應(yīng)用同一劑量進(jìn)行HIFU 消融，未針對(duì)不同能量、時(shí)間、消融方式等進(jìn)行分組，待以后進(jìn)一步研究以確定更有效地消融和釋放藥物，獲得最佳的治療效果。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)制備的FR-HCPT-PNPCA 既是一種高效的HIFU 增效劑，又是一種協(xié)同HIFU 消融的靶向藥物，二者聯(lián)合能顯著增強(qiáng)HIFU 的消融療效和生物安全性，有望為腫瘤治療提供一種精準(zhǔn)、高效的手段。