18F-硼氨酸細胞攝取機制研究

李 詝 李 囡 劉志博 楊 志*

(1. 北京大學腫瘤醫院暨北京市腫瘤防治研究所核醫學科 惡性腫瘤發病機制及轉化研究教育部重點實驗室，北京 100142； 2. 北京大學化學與分子工程學院，北京 100871)

氨基酸、糖類以及核酸是人類三大最基本的營養物質。正因如此，氨基酸轉運載體(amino acid transporter, AAT)也成為人體內最為重要的營養物質與神經信號分子的轉運體系之一[1]。多年的研究[2-3]表明，某些氨基酸轉運體，如L型氨基酸轉運體-1(large-neutral amino acid transporter-1,LAT-1)在惡性腫瘤細胞表面有著特異性的高表達，且它們的表達程度與腫瘤的惡性程度呈正相關。因此，通過無創性的PET影像對轉運體的表達進行評測，對癌癥的診斷有著重大的臨床價值，同時也是發展新一代PET影像探針的重要途徑[4-5]。

本研究所用的新型分子探針——F-18標記的苯丙硼氨酸(18F-BF3-Phe)是一系列全新的化合物——硼氨酸中的一種[6]。硼氨酸中的三氟化硼(-BF3)的引入，在基本不改變其體內活性的同時，一方面顯著地提高了硼氨酸的生物穩定性，另一方面為F-18的標記帶來了極大的便捷。相比于傳統的放射性氨基酸的標記，生產步驟大大簡化[7]。此外，細胞實驗[8-9]證實，硼氨酸經由對應的氨基酸的轉運載體進入細胞，并在特異性上和天然氨基酸相似。且既往的動物實驗[10]證實：18F-BF3-Phe在活體內有良好的穩定性，而在腫瘤內有很高的特異性攝取，且在炎癥中的攝取較低，與傳統的氨基酸分子探針相比，優勢明顯。

本研究采用半自動方法對18F-BF3-Phe進行了標記，并完善了LAT-1轉染細胞和多種腫瘤細胞放射性攝取實驗，通過系統的細胞實驗，建立18F-硼氨酸細胞攝取與LAT-1轉運體表達的定量關系，初步闡述了18F-硼氨酸在癌細胞中的攝取機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

二氯甲基甲基醚、三氟甲磺酸甲酯、二異丙胺基鋰、苯基硅烷、無水乙腈、四丁基氟化銨(北京化工廠)；Sep-pak C18柱(美國Waters公司)；Muhiscreem抽濾板(美國Millipore公司)；氟多功能模塊(北京派特公司)；RM905型放射性活度儀(中國計量科學研究院)；FT-163γ井型計數器(北京核儀器廠)；pH測量計(意大利Hanna公司)；伽馬計數儀(美國Packard公司)。

293T細胞、人肺腺癌PC9細胞、人胰腺導管細胞癌BXPC3細胞、人前列腺癌PC3細胞、人肝細胞癌HEPG2細胞(國家生物醫學實驗細胞資源庫)；DMEM培養基、RPMI-1640培養基、0.25%(質量分數)胰酶、青霉素鏈霉素溶液(美國Hyclone公司)；Opti-MEM培養基、胎牛血清(美國Gibco公司)；Lipofectin試劑(美國Invitrogen公司)。

1.2 18F-BF3-Phe的放射性標記

BF3-Phe的化學合成參照Liu等[6]的文獻報道完成。

放射性標記采用18F-19F同位素交換法(圖1)，使用氟多功能模塊進行標記反應。標記條件為：0.5 mg苯丙硼氨酸(BF3-Phe)，反應溫度80 ℃，反應pH=2.0～2.5，反應時間10 min。反應結束后，反應混合物使用Sep-pak C18柱純化，產物最終經Millipore無菌針頭式過濾器除菌后使用。

圖1 18F-19F同位素交換法標記苯丙硼氨酸Fig.1 18F-BF3-Phe is radio-synthesized via one-step 18F-19F isotope exchange

1.3 質量控制

1.3.1 化學純度及放化純度的檢測

采用高效液相色譜法作化學純度與放化純度分析。液相系統由Waters515、Waters486紫外檢測器和γ-RAM檢測器構成。采用Waters C18色譜柱，檢測波長262 nm，以乙腈∶醋酸/醋酸銨緩沖溶液(pH=4)=15∶85為流動相。

1.3.2 pH值的測定

標記反應pH值及終產物pH值由pH計測定。

1.3.3 安全性與異常毒性實驗

18F-BF3-Phe溶液經Millipore無菌針頭式過濾器除菌后送細菌室進行細菌培養。細菌內毒素實驗采用鱟試驗法，參照《中華人民共和國藥典》(2015年版，四部)[11]規定的細菌內毒素檢查法，依次完成鱟試劑靈敏度的復核、注射液的干擾實驗和樣品細菌內毒素的檢查。

異常毒性實驗：選取4～6周齡ICR小鼠5只，體質量為19～21 g，按正常飼養條件飼養。每只尾靜脈注射18F-BF3-Phe注射液0.2 mL，劑量為37 MBq，其劑量相當于體質量為60 kg的人用劑量的300倍。注射前后稱小鼠體質量，觀察注射后48 h小鼠生存、飲食、活動及體質量變化及1周后生存情況。

1.4 LAT-1轉染細胞攝取實驗

1.4.1 細胞轉染實驗

提前24 h將用DMEM培養基[10%(體積分數)胎牛血清]培養的293T細胞消化后種植在12孔培養板上，細胞懸液濃度為5×105mL，每孔體積1.0 mL。批量配制人LAT-1基因質粒DNA稀釋液，對于每孔細胞，使用50 μL Opti-MEM培養基稀釋0.5 μgDNA。其中兩孔使用插入mCherry序列的人LAT-1基因質粒DNA，使其同時表達熒光蛋白，用于在熒光顯微鏡下間接評估轉染效率。批量配制Lipofectin試劑稀釋液，對于每孔細胞，使用50 μL Opti-MEM培養基稀釋1.5 μL Lipofectin試劑。Lipofectin 稀釋后，在5 min內同稀釋的DNA混合?；旌舷♂尯蟮腄NA和Lipofectin復合物在室溫保溫20 min。將提前鋪好板的293T細胞換液后在培養箱中培養30 min，然后直接將復合物100 μL加入到每孔中，搖動培養板，輕輕混勻。加入復合物后的293T細胞置入37 ℃，5%(體積分數)CO2培養箱中培養24 h，在熒光顯微鏡下觀察加有插入mCherry序列的人LAT-1基因質粒DNA的細胞孔，評估轉染效率。

1.4.2 LAT-1轉染細胞攝取實驗

提前24 h將已轉染人LAT-1基因質粒DNA的293T細胞及未轉染的293T細胞，按照轉染細胞占0%、20%、40%、60%、80%及100%的比例混合接種于24孔板，每種比例設置4個復孔，每孔體積0.5 mL，細胞數量為5×105mL，置入37 ℃、5%(體積分數)CO2培養箱中培養24 h。從培養箱中取出細胞，小心吸掉培養基，每孔用1 mL事先預熱(37 ℃)的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，包含0.9 mol/L Ca2+和1.05 mol/L Mg2+)清洗3次。每孔中加入0.5 mL PBS配制的18F-BF3-Phe 37kBq(1.0 μCi)，放入37 ℃、5%(體積分數)CO2培養箱中培養。30 min后取出培養板，小心吸掉PBS，每孔用1 mL不含Ca2+和Mg2+的冷PBS清洗3次。每孔加入0.2 mL 0.1 mol/L NaOH收集細胞，將每孔中液體移入EP管中，使用伽馬計數儀計量放射性計數。

1.5 多種腫瘤細胞攝取實驗

提前24 h將PC9、 BXPC3、PC3、HEPG2細胞分別用0.25%(質量分數)胰酶消化，離心后去掉上清，用RPMI-1640培養基[10%(體積分數)胎牛血清]制成單個細胞懸液，細胞計數儀測定細胞數量為1×106mL，將各細胞株接種于24孔培養板上，每孔體積0.5 mL，置入37 ℃、5%(體積分數)CO2培養箱中培養24 h。每種細胞株設置15、30、60 min 3個時間點，每個時間點設置4個復孔。從培養箱中取出細胞，小心吸掉培養基，每孔用1 mL 37 ℃預熱的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，含0.9 mol/L Ca2+和1.05 mol/L Mg2+)清洗3次。每孔中加入0.5 mL PBS配制的18F-BF3-Phe 37 kBq(1.0 μCi)，放入37 ℃、5%(體積分數) CO2培養箱中培養。分別于15、30、60 min后取出培養板，小心吸掉PBS，每孔用1 mL不含Ca2+和Mg2+的冷PBS清洗3次。每孔加入0.2 mL 0.1 mol/L NaOH收集細胞，將每孔中液體移入EP管中，使用伽馬計數儀計量放射性計數。

2 結果

2.1 標記及質控實驗

BF3-Phe的模塊化標記呈現良好的可重復性，標記產率可達到30%～40%，標記后的硼氨酸無須高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)純化，穩定性好。HPLC質控結果可見，標記所得的硼氨酸有較高的放射化學純度與化學純度(圖2)。標記后終產物pH值為中性7.0。細菌培養及細菌內毒素檢查均為陰性。異常毒性實驗小鼠活動正常，無死亡。18F-BF3-Phe注射液無菌、安全無毒性，符合醫用放射性探針基本要求。

圖2 標記后的苯丙硼氨酸具有很高的化學純度和放射性純度Fig.2 18F-BF3-Phe with high chemical purity and radiochemical purity was obtained

2.2 LAT-1轉染細胞攝取實驗

2.2.1 細胞轉染實驗

有兩孔293T細胞使用了插入mCherry序列的人LAT-1基因質粒DNA進行轉染，使其可同時表達mCherry熒光蛋白，這樣轉染成功的細胞會同時在細胞膜表達LAT-1及mCherry熒光蛋白，即在熒光顯微鏡下可見，可間接反映用人LAT-1基因質粒DNA進行轉染的效率。轉染插有mCherry序列的人LAT-1基因質粒DNA的293T細胞，培養24 h后在熒光顯微鏡下觀察結果，轉染效率約為40%～50%(圖3)。

圖3 轉染插有mCherry序列的人LAT-1基因質粒DNA的293T細胞，培養24 h后在熒光顯微鏡下觀察(40×)Fig.3 The fluorescent image of 293T cells transfected by human LAT-1 gene plasmid DNA inserted with mCherry sequence after 24 h culture LAT-1：large-neutral amino acid transporter-1.

2.2.2 LAT-1轉染細胞攝取實驗

加入37kBq18F-BF3-Phe培養30 min后，可見細胞的放射性攝取隨著LAT-1轉染細胞比例的增加而逐漸增加，基本呈線性關系(表1，圖4)。

表1 各比例轉染LAT-1的293T細胞攝取18F-BF3-Phe情況Tab.1 Uptake of 18F-BF3-Phe in LAT-1-293T with different transfection level

圖4 18F-BF3-Phe攝取值與轉染LAT-1的293T細胞的比例呈正相關Fig.4 The uptake of 18F-BF3-Phe was positively correlated with the proportion of LAT-1-293TLAT-1： large-neutral amino acid transporter-1; %AD： the percentage of cell uptake in total radioactivity.

2.3 多種腫瘤細胞攝取實驗

如表2所示為不同腫瘤細胞分別在加入18F-BF3-Phe 15、30、60 min后的 %AD值，圖5為相應的曲線圖?？梢?8F-BF3-Phe在PC9、BXPC3、PC3、HEPG2 4種腫瘤細胞中均有攝取，并隨時間推移呈逐漸增加趨勢。其中PC9及BXPC3細胞對18F-BF3-Phe的攝取更為顯著，隨時間推移攝取明顯增加。

表2 不同腫瘤細胞在加入18F-BF3-Phe 15、30、60 min后的%AD值Tab.2 The uptake of 18F-BF3-Phe in different cell lines after 15, 30 and 60 min 18F-BF3-Phe incubation %AD

圖5 不同腫瘤細胞在不同時間點18F-BF3-Phe攝取值Fig.5 The uptake of 18F-BF3-Phe in various cell lines with different incubating time%AD： the percentage of cell uptake in total radioactivity.

3 討論

本研究采用半自動方法對苯丙硼氨酸(18F-BF3-Phe)進行標記，相較于18F-FDG、11C-MET等傳統的放射性分子探針，硼氨酸的放射性標記無須共沸干燥與HPLC純化，一步即可完成標記，且標記產率較高、純度好、比活度高，所生產的18F-BF3-Phe注射液無菌、安全、無毒性，較11C-MET等其他氨基酸放射性分子探針有明顯優勢，將更易于今后進行臨床轉化。

LAT-1是一種不依賴鈉離子的氨基酸轉運體。主要存在于腦、結腸、肺、肝臟、胸腺、卵巢、皮膚及腫瘤細胞中，跨細胞膜轉運例如酪氨酸、苯丙氨酸這類大分子中性氨基酸。所有氨基酸均是親水的，因此必須在選擇性轉運蛋白的幫助下才能通過細胞膜。大部分氨基酸轉運體可以識別不止一種氨基酸。因為腫瘤細胞對氨基酸的需要量很大，其細胞表面的選擇性氨基酸轉運體的數量自然會上調以滿足對氨基酸的需要。因此，LAT-1在多種腫瘤中高表達，包括惡性膠質細胞瘤、非小細胞肺癌等，其表達與腫瘤的增殖、血管生成及較差的預后密切相關。并且LAT-1隨著腫瘤的進展表達相應增高，在高級別腫瘤及已有轉移的腫瘤中均可見其表達更高。特別是，LAT-1在腫瘤相關的代謝網絡中扮演重要角色，向腫瘤細胞生長提供必需氨基酸和一些促進增殖的信號分子，比如可以激活mTOR旁路的分子。并且，抑制LAT-1的功能可以減少腫瘤細胞的增殖，這使其可以成為一個新型的抗腫瘤治療的可行靶點?；贚AT-1上述在腫瘤組織中高表達的特點，用放射性標記對應氨基酸進行PET顯像即可明確LAT-1表達情況，進而進行腫瘤顯像并了解其增殖、預后等情況。

硼氨酸擁有與天然氨基酸完全一致的側鏈結構，它們是天然氨基酸的等電子體[6]。經細胞實驗[6]證實，硼氨酸經由對應的氨基酸轉運載體進入細胞，并在渠道選擇性上和天然氨基酸基本一致。本研究中所用顯像劑苯丙硼氨酸(18F-BF3-Phe)，即為一種苯丙氨酸類似物，通過LAT-1轉運，可較特異性的被腫瘤攝取，并且不參與蛋白質代謝，是一種很有用的氨基酸顯像劑。

LAT-1轉染細胞攝取實驗意在明確18F-BF3-Phe與LAT-1轉運體表達的相關性，以證實其確實經LAT-1轉運并可顯示LAT-1的表達情況。在細胞轉染實驗中，有兩孔293T細胞使用了插入mCherry序列的人LAT-1基因質粒DNA進行轉染，使其可同時表達mCherry熒光蛋白，這樣轉染成功的細胞會同時在細胞膜表達LAT-1及mCherry熒光蛋白，即在熒光顯微鏡下可見，可間接反映用人LAT-1基因質粒DNA進行轉染的效率。24 h后在熒光顯微鏡下觀察插入mCherry序列的人LAT-1基因質粒DNA轉染的效率約為40%～50%，可推測用人LAT-1基因質粒DNA進行轉染的效率與之相似或高于插入mCherry序列的人LAT-1基因質粒DNA的轉染效率(新插入多余的序列并不一定在原質粒DNA中均成功插入，可能使轉染效率被低估)，因此293T細胞轉染人LAT-1基因質粒DNA成功，其細胞膜表面高表達LAT-1，可用于后續細胞攝取實驗。而在18F-BF3-Phe細胞攝取實驗中，細胞所攝取的放射性隨著LAT-1轉染細胞的增多而增多，呈現出明顯的18F-BF3-Phe攝取與LAT-1表達的正相關性。證實了18F-BF3-Phe同苯丙氨酸一樣經LAT-1轉運，并且可體現LAT-1的表達高低，這是后續一系列實驗的基本理論依據，為后續的腫瘤細胞實驗，以及未來的動物以及人體實驗打下了良好的基礎。

雖有研究[12]表明LAT-1在各種腫瘤細胞中高表達，但其在不同腫瘤細胞中高表達程度卻也不盡相同，并且在同一種腫瘤中，由于不同的分化或分級程度以及是否轉移等因素,LAT-1的表達會有所差異[13]。本研究選擇了PC9(人肺腺癌細胞)、BXPC3(人胰腺導管細胞癌細胞)、PC3(人前列腺癌細胞)、HEPG2(人肝細胞癌細胞)4株人常見腫瘤細胞系進行腫瘤細胞攝取實驗，以了解18F-BF3-Phe在不同腫瘤中的攝取情況。在加入18F-BF3-Phe15、30、60 min后，可見PC9、BXPC3、PC3、HEPG2 4種腫瘤細胞中均有放射性攝取，并且隨時間推移均呈逐漸增加趨勢。其中PC9及BXPC3細胞對18F-BF3-Phe的攝取更為顯著，隨時間推移攝取明顯增加。雖然這4株細胞只是肺腺癌、胰腺癌、前列腺癌及肝細胞癌的一個細胞株，但也還是具有一定的代表性，根據這個細胞攝取結果可以預測18F-BF3-Phe在肺癌及胰腺癌顯像中會有更好的效果，未來的動物實驗可選擇PC9及BXPC3細胞建立腫瘤動物模型。另外，根據既往研究[6]結果，18F-BF3-Phe在人膠質瘤細胞株U87MG中亦有較高攝取，適于進行腫瘤動物模型顯像。并可以推測在人體內相關腫瘤也會有較好顯像效果，為未來的臨床轉化提供了理論基礎。

結論:1)本研究首先對新型分子探針18F-BF3-Phe進行了模塊化成功標記，方法簡便高效。通過LAT-1轉染細胞攝取實驗顯示18F-BF3-Phe攝取與LAT-1轉運體表達之間呈正相關，明確了18F-BF3-Phe經由LAT-1進入細胞的攝取機制，為進一步的體內實驗提供了重要的理論基礎。2)多種腫瘤細胞攝取實驗顯示18F-BF3-Phe在多種腫瘤細胞中均有高攝取，顯示該探針在腫瘤顯像方面進行臨床轉化的良好前景。