基于網絡藥理學的侯氏黑散抗缺血性腦卒中機制研究

王 璇 馬重陽 張雅文 程宏發 張秋霞

(首都醫科大學中醫藥學院中醫臨床基礎學學系 中醫絡病研究北京市重點實驗室，北京 100069)

腦卒中作為世界范圍的三大疾病之一，具有高發病率、高致殘率和高致死率的特點，給家庭和社會帶來沉重的負擔[1]。腦卒中屬于中醫“中風”的范疇，《金匱要略》首次設置“中風歷節病脈證治第四”專篇論述中風病[2]。侯氏黑散為仲景治療缺血性中風的“第一方”，體現了“補不足，損有余”的治療法則[3]。目前，已有大量的臨床研究[4-6]顯示，侯氏黑散在缺血性腦卒中的預防及治療中具有的顯著療效，而侯氏黑散的實驗研究[7-10]聚焦的治療靶點和信號通路主要集中在抗凋亡、調節炎性反應和促進血管新生等方面。網絡藥理學是整合了系統生物學、多向藥理學、計算生物學、網絡分析等多學科的技術和內容的一門新興學科，基于“疾病-基因-靶標-藥物”相互作用網絡，從整體的角度去探索藥物與疾病間的關聯性，系統地觀察藥物對疾病網絡的干預與影響。這與復方中藥組方配伍的整體觀相契合，反映了大數據時代復方中藥系統性研究的新趨勢[11-12]。本文將從侯氏黑散的藥效成分和靶點的篩選展開，通過建立“成分-靶標-疾病-通路”網絡，探究其治療缺血性腦卒中的作用機制，為后續實驗提供參考和依據。

1 資料與方法

1.1 研究思路

本實驗關于侯氏黑散治療缺血性腦卒中的網絡藥理學實驗思路可概括為侯氏黑散活性成分、活性成分作用靶點、腦缺血靶點數據庫建立，“成分-靶點-通路”網絡建立與分析兩部分，詳見圖1。

圖1 侯氏黑散抗腦缺血的網絡藥理學研究思路Fig.1 Network pharmacology research processes of Houshiheisan for treatment of ischemic strokeTCMSP: traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform; KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes.

1.2 數據庫建立

1.2.1 侯氏黑散活性成分挖掘與篩選

中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)提供了中藥成分中化合物的吸收、分布、代謝、排泄(absorption, distribution, metabolism, excretion, ADME)參數，通過設置口服吸收利用度(oral bioavailability, OB)≥30%、血-腦脊液屏障(blood-brain barriers, BBB)≥-0.3和藥物相似性(drug likeness, DL)≥0.18參數，篩選出侯氏黑散方中的主要活性成分。利用Pubchem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)和Shemsrc數據庫(https://www.chemsrc.com/en/)檢索相關化學成分的CAS編號和分子式信息。

1.2.2 侯氏黑散活性成分作用靶點預測

TCMSP數據庫檢索侯氏黑散活性成分對應的靶點。利用Cytoscape 3.7.2軟件[13]構建侯氏黑散活性成分-靶點作用網絡并進行拓撲分析，在網絡中，節點代表活性成分或靶點，邊代表活性成分與靶基因間的相互作用關系，Degree值是每一個節點連接的邊，一個節點與更多其他節點產生相互作用，這個節點的Degree值也就越高。因此Degree值能夠反映節點在網絡中的重要性，Degree值大的節點被認為是中心節點[11,14]。利用軟件中的Network Analyzer工具計算Degree值來評價網絡中成分和靶點的重要性。將不同來源的靶標輸入UniProt數據庫 (http://www. uniprot. org)中檢索，限定物種為人，得到靶點對應的Gene Symbol，用于后續網絡藥理學分析。

1.2.3 缺血性腦卒中靶點挖掘

在OMIM(https://www.omim.org/)、Drug bank(http://www.drugbank.ca/)、GAD(http://geneticassociation-db.nih.gov/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)數據庫中檢索“cerebral ischemia/ischemic stroke”關鍵詞，得到腦缺血相關靶點信息。

1.3 侯氏黑散抗缺血性腦卒中的“成分-靶點-通路”分析

1.3.1 成分-靶點網絡構建

將活性成分靶點與疾病靶點的Gene Symbol信息導入Venny 2.1在線工具 (http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)繪制韋恩圖，交集部分認為是侯氏黑散抗缺血性腦卒中的關鍵靶點(藥效靶點)。利用Cytoscape 3.7.2軟件，構建侯氏黑散抗缺血性腦卒中成分-靶點相互作用網絡，利用軟件中的Network Analyzer工具計算Degree值來評價網絡中成分和靶點的重要性。

1.3.2 蛋白相互作用網絡構建

利用STRING數據庫(https://string-db.org/)構建蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡，選擇multiple proteins選項，將關鍵靶點的Gene Symbol信息導入，限定物種為人，獲取蛋白相互作用關系，結果以.tsv文件格式導出。得到的.tsv文件導入Cytoscape軟件，進一步繪制PPI網絡圖。利用軟件中的Centiscape 2.2插件對網絡中的蛋白進行中心性分析。將節點邊的大小和顏色設置用于分別反映Degree值和Combine score值的大小，獲得最終的蛋白相互作用網絡圖。

1.3.3 “靶點-功能-通路”網絡構建

將交集靶點的Gene Symbol信息導入KOBAS在線服務器[15](http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/?t=1)，設定物種為人，進行京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析，得到侯氏黑散抗腦缺血的重要信號通路及相關參數，結果保存為.txt文件。利用Omicshare網站(https://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/seniorbubble)對相關KEGG信號通路進行可視化處理，按照網站提供的模版導入包含通路信息的文件，繪制KEGG結果的高級氣泡圖。利用KEGG Mapper工具(https://www.genome.jp/kegg/mapper.html)分析相關靶點在重要信號通路中的具體作用，得到侯氏黑散調控信號通路的模式圖。

2 結果

2.1 侯氏黑散與缺血性腦卒中共同靶標確定

由于無法在TCMSP數據庫中檢索到牡蠣、礬石的相關信息，本文分析了侯氏黑散中其他十二味藥物(菊花、白術、防風、桔梗、黃芩、細辛、干姜、人參、茯苓、當歸、川芎、桂枝)的成分信息，篩選出了侯氏黑散方中的81個不重復活性成分，按照OB值大小排列，排名前20的有黃芩新素(neobaicalein)、苯代南蛇堿(celabenzine)、隱品堿(cryptopin)、二甲氧基黃酮(panicolin)、黃芩黃酮Ⅱ(skullcapflavone Ⅱ)等，具體成分信息詳見表1。

表1 侯氏黑散OB值排名前20活性成分信息Tab.1 Informations of the top 20 active components in OB value of Houshiheisan

續表1

數據庫檢索得到活性成分的相關靶點112個，利用Cytoscape 3.7.2軟件構建活性成分-靶點相互作用網絡，得到了一個包含184個點和1 315條邊的網絡圖(圖2)。其中，Degree值排名前5的靶點有雌激素受體1(estrogen receptor, ESR1)、雄激素受體(androgen receptor, AR)、前列腺素G/H合酶2(prostaglandin G/H synthase 2, PTGS2)、二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase 4,DPP4)、一氧化氮合酶2(nitric oxide synthase, inducible,NOS2)，它們的Degree值分別是63、61、49、47、44。

圖2 侯氏黑散的活性成分-靶點網絡Fig.2 Active component-target network of Houshiheisan

通過關鍵詞檢索Drug bank、OMIM、GAD、TTD 4個在線數據庫，得到了316個缺血性腦卒中的相關靶點。韋恩圖(圖3)構建出活性成分-靶點和疾病-靶點的交集部分，共有22個交集靶點用于后續的網絡藥理學分析。

圖3 侯氏黑散抗腦缺血靶點韋恩圖Fig.3 Venn diagram of targets of Houshiheisan for treatment of ischemic stroke

2.2 侯氏黑散治療腦卒中藥效成分篩選

將得到的交集靶點作為藥效靶點，利用Cytoscape 3.7.2構建藥效靶點-成分相互作用網絡(圖4)。Degree值排名前10的藥效靶點及相關信息詳見表2。Degree值排名前5的藥效成分分別為β-谷甾醇、隱品堿、原阿片堿、豆甾醇、山姜素，它們的Degree值分別是49、45、44、43、36。

圖4 侯氏黑散抗腦缺血成分-藥效靶點網絡Fig.4 Active component-effective target network of Houshiheisan for treatment of ischemic strokeESR1： estrogen receptor1； AR： androgen receptor； NR3C1： glucocorticoid receptor； PTGS2： prostaglandin G/H synthase 2； F2： prothrombin； NOS3：nitric oxide synthase, endothelial； F7： coagulation factor Ⅶ； KDR：vascular endothelial growth factor receptor 2.

表2 Degree值排名前10的侯氏黑散抗腦缺血靶點Tab.2 Top 10 anti-cerebral ischemia targets in degree value of Houshheisan

2.3 PPI網絡分析

將侯氏黑散抗腦缺血的關鍵靶點輸入STRING數據庫分析，得到蛋白質相互作用網絡。Cytoscape軟件處理后，得到了一個有22個節點和82條連線構成的關聯網(圖5) 。圖中的節點代表蛋白，邊表示蛋白和蛋白間的關聯，節點越大，顏色越深表示關聯度越高。處于網絡中心的靶點有血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A, VEGFA)、腫瘤抑制蛋白(cellular tumor antigen p53, TP53)、白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)、內皮型一氧化氮合酶(nitric oxide synthase， endothelial,NOS3)、PTGS2等，他們的節點度分別為14、14、14、13、12、12。

圖5 侯氏黑散抗腦缺血藥效靶點的蛋白-蛋白相互作用網絡Fig.5 Protein-protein interaction network of effective targets of Houshiheisan for treatment of ischemic strokeVEGFA: vascular endothelial growth factor A; TP53: cellular tumor antigen p53; IL-6: interleukin-6; TNF: tumor necrosis factor;PTGS2: prostaglandin G/H synthase 2; NOS3: nitric oxide synthase, endothelial.

2.4 核心PPI網絡的KEGG信號通路富集分析

利用KOBAS在線服務器和Omicshare 工具對22個關鍵靶點進行KEGG富集分析，得到侯氏黑散抗腦缺血的重要信號通路。按P值大小對排名前20的信號通路進行可視化處理(圖6)，根據P值大小、富集因子大小和抗腦缺血相關性，認為重要的信號通路包括流體剪切應力通路、晚期糖基化終產物-晚期糖基化終產物受體(advanced glycation end products/receptor for advanced glycation end products, AGE-RAGE)通路、缺氧誘導因子1-α/血管內皮生長因子(hypoxia inducible factor1-α/vascular endothelial growth factor, HIF1-α/VEGF)通路等。利用KEGG Mapper工具，分析侯氏黑散靶點在流體剪切應力通路、AGE-RAGE信號通路中的具體作用，得到侯氏黑散調控上述信號通路的模式圖(圖7、8)。

圖6 侯氏黑散抗腦缺血藥效靶點的KEGG富集分析Fig.6 KEGG enrichment analysis of effective targets of Houshiheisan for treatment of ischemic strokeKEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes.

圖7 流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路Fig.7 Fluid shear stress and atherosclerosis signaling pathwayNOS3： nitric oxide synthase, endothelial； TP53： cellular tumor antigen p53； AP-1： activator protein 1； TNF： tumor necrosis factor； VEGFA： vascular endothelial growth factor A； KDR： vascular endothelial growth factor receptor 2； BCL2： apoptosis regulator Bcl-2.

圖8 晚期糖基化終產物-晚期糖基化終產物受體信號通路Fig.8 Advanced glycation end products-advanced glycation end product receptor (AGEs-RAGE) signaling pathwayNOS3： nitric oxide synthase, endothelial；AP-1： activator protein 1； IL-6： interleukin-6； TNF： tumor necrosis factor； VEGFA： vascular endothelial growth factor A； BCL2： apoptosis regulator Bcl-2.

3 討論

缺血性腦卒中占全部腦血管病患者的70%～80%，主要包括腦血栓形成和腦栓塞，腦組織缺血再灌注后的損傷與血流減少、能量代謝障礙、氧化應激、Ca2+超載、細胞凋亡等眾多因素有密切關系[16-17]。缺血性腦卒中病理機制復雜多樣，涉及大量信號通路網絡的失調。醫圣張仲景在《金匱要略·中風歷節病篇》中記載“侯氏黑散治大風，四肢煩重，心中惡寒不足者”,“大風”指風邪直中臟腑，即中醫學的“中風病”;“四肢煩重”即四肢沉重，活動不利而煩悶;“心中惡寒不足”點明了侯氏黑散治療的中風類型是陽氣不足為主要病機的證型[2,18]。侯氏黑散由人參、白術、茯苓、干姜、當歸、川芎、防風、菊花、桂枝、桔梗、細辛、牡蠣、礬石十四味藥組成，具有補益氣血，祛風通絡的功效。前期研究[7-10]結果顯示，侯氏黑散具有抗細胞凋亡、調節炎性反應和保護神經血管等作用。為進一步探究侯氏黑散抗腦缺血的藥效物質及作用靶點，筆者通過藥效成分篩選、靶標預測、蛋白相互作用分析和KEGG富集分析得出了網絡藥理學相關結果。

利用TCMSP數據庫以及Cytoscape構建藥效靶點-成分相互作用網絡，篩選出侯氏黑散抗缺血性腦卒中的5個主要藥效成分為β-谷甾醇、隱品堿、原阿片堿、豆甾醇、山姜素[14，19-20]。β-谷甾醇是菊花、防風、干姜、黃芩、人參、當歸、桂枝的共同成分；豆甾醇是人參、當歸、黃芩的共同成分；隱品堿為細辛的成分； 山姜素為黃芩的成分；原阿片堿為人參的成分。其中，β-谷甾醇和豆甾醇是植物甾醇類成分[21]，均具有抗感染、抗氧化和改善神經功能的潛在作用[21-23]；隱品堿和原阿片堿為異喹啉生物堿一類化合物，能夠作用于血管系統和神經系統，靶向PTGS2、凝血因子Ⅶ(coagulation factor Ⅶ, F7)、血管內皮細胞生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2, KDR)起到抗感染、抗氧化、抗血小板聚集、保護血管等作用[24-25]；山姜素具有激動過氧化物酶體增殖物激活受體遏制炎性反應介質的合成，從而起到抑制炎性反應的作用[26]。

利用STRING數據庫以及Cytoscape軟件預測侯氏黑散抗腦缺血可能作用的靶點有ERS1、AR、PTGS2、凝血酶原(prothrombin, F2)、NOS3等。此外，Degree值排名前5的藥效成分共同靶向ERS1、AR、PTGS2這些抗腦缺血靶點。中樞神經系統中的雌激素和雌激素受體能夠通過核和非核作用參與運動協調、認知功能、突觸可塑性、記憶和學習以及社會行為的調節過程，還可以通過減輕氧化應激和降低炎性反應因子(如腫瘤壞死因子等)表達發揮血管舒張和神經保護作用[27-28]。PTGS2又稱環氧化酶2，是炎性反應因子的下游因子之一，在包括腦組織的人體各組織細胞中廣泛表達，它的活性產物(如前列環素)參與了包括炎性反應、疼痛、內皮抗血栓的眾多生理和病理過程中，能夠參與介導腦缺血后的炎性反應[29]。

KEGG富集分析結果顯示，流體剪切應力通路、AGE-RAGE通路、HIF1-α/VEGF通路等是侯氏黑散發揮抗腦缺血作用的排名靠前的信號通路。流體剪切應力是血管內因血流摩擦管壁產生的平行于血流方向的切線應力，對維持血管內皮結構和功能的完整性具有重要意義[30]。研究[30-31]證實，內皮細胞上的機械感應和信號轉導是相互聯系的，細胞膜上的很多生物分子(如整合素、酪氨酸激酶受體、G蛋白偶聯受體等)都可以作為剪切應力改變的機械傳感器。例如，血栓發生或動脈斑塊形成時，血流方向受擾呈湍流狀態，持續的低剪切應力下，激活子蛋白-1(activator protein 1, AP-1)和核因子-κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)的激活，內皮細胞中促炎、促凋亡的基因和蛋白的表達上調，內皮功能受損，NOS3和KDR表達下調，炎性反應、氧化應激激活從而使血管新生受到抑制。AGEs是大分子物質糖基化形成的不可逆終末產物，其受體之一RAGE屬于免疫球蛋白超家族[32]。在炎性反應、缺血再灌注損傷和缺氧等病理狀態下，AGE-RAGE軸活化，一方面，轉錄因子NF-κB激活而AP-1受到抑制，刺激炎性反應因子和凝血因子激活導致炎性反應擴大，內皮細胞損傷加重，VEGF等促血管新生因子合成減少，血管新生受到抑制；另一方面，NF-κB表達增加又能上調RAGE，形成正反饋環[32-33]，使上述情況進一步加重。研究[8,10]顯示，侯氏黑散能通過調節腦缺血大鼠大腦皮質VEGF/HIF-1α軸活性而發揮抗腦缺血的作用，這與分析結果相吻合。總之，侯氏黑散可能是通過對流體剪切應力、AGE-RAGE、HIF-1α/VEGF等通路能夠聯動地起到抗感染、抗氧化、抗凋亡作用，從而起到抗腦缺血損傷的作用。

結果顯示，方中成分或作用于多個靶標、通路，或多個成分作用于同一個靶標、通路，這正體現了中藥復方多成分、多靶標、多通路的復雜網狀關系。調控通路涉及炎性反應、凋亡及血管新生等各個環節，各通路群間通過共有靶標連接，顯示出不同成分間的多靶標協同作用。侯氏黑散的網絡藥理學結果初步驗證了其抗腦缺血的相關機制，而這一結果尚需進一步實驗數據的支持。