膜性腎病與非編碼RNA

車秀清 米 焱 王彩麗

膜性腎病(membranous nephropathy，MN)是一種腎臟特異性的自身免疫性疾病，是成人腎病綜合征常見的病理類型之一，約1/3的MN患者會進展為終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)。目前，MN的確診仍依靠腎穿刺活組織檢查(簡稱活檢)，以監測病情變化和治療效果，但因其為有創檢查，不便反復進行，因此仍需要不斷積極探索MN的發病機制和新型生物標志物，非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)研究的不斷深入為闡明MN的發生機制提供了思路，也為MN的診斷和治療帶來了希望。

1 MN的發病機制

MN的病理學特征表現為腎小球基底膜上皮細胞下免疫復合物沉積伴基底膜彌漫增厚。其中大多數病因不明的MN被稱為特發性膜性腎病(idiopathic membranous nephropathy, IMN)或原發性膜性腎病(primary membranous nephropathy，PMN)，而由自身免疫性疾病(系統性紅斑狼瘡等)、感染、腫瘤、代謝性疾病、藥物等引起的MN被稱為繼發性膜性腎病(secondary membranous nephropathy，SMN)。IMN的發病機制復雜，具體機制尚未完全明確，可能有多重因素參與。近年來，IMN特定抗原的發現促進了IMN的機制研究和診斷。研究發現，多種足細胞膜抗原如M型磷脂酶A2受體(PLA2R)[1-2]、Ⅰ型血小板反應蛋白7A域(THSD7A)[3]、中性肽鏈內切酶(NEP)[4]與IMN的發生有關。血清中超氧化物歧化酶(SOD2)、醛糖還原酶(AR)、α-烯醇化酶(α-ENO)等細胞內抗原也可能是導致IMN發生的抗原成分[5]。其中PLA2R1抗體(PLA2R1-Ab)水平與疾病活動和緩解、藥物治療反應[6]、腎移植后疾病復發[7]相關，并且可以預測腎臟長期預后[8-9]，血清PLA2R1-Ab檢測已應用于IMN的臨床診斷和治療。此外，遺傳易感性[10]、環境因素[11]、補體激活[12]等也與IMN的發生有關。

2 ncRNA的分類

人類基因組中只有約1.5%可以編碼為蛋白質，絕大部分轉錄為ncRNA，ncRNA是一類不能編碼蛋白質而在轉錄前或轉錄水平發揮生物學功能的RNA，包括核糖體RNA(ribosomal RNA，rRNA)、轉運RNA(transfer RNA，tRNA)、小核RNA(small nuclear RNA,snRNA)、小核仁RNA(small nucleolar RNA，snoRNA)、長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)、環狀RNA(circular RNA，circRNA)、微RNA(microRNA，miRNA)和小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)等。

隨著基因測序技術和生物信息學的發展，ncRNA的種類不斷被完善，其生物學功能也逐漸受到重視，成為近年來生命科學的研究熱點，其中對miRNA的研究較為豐富。許多研究結果表明，ncRNA在細胞生命活動中發揮著重要作用，并且ncRNA表達失調與多種疾病的發生、發展過程有關，也可能參與了多種腎病的病理生理過程。探究ncRNA與MN的關系有利于闡明MN的發病機制，為治療MN提供新的治療靶點。ncRNA在血液、尿液中穩定存在，可無創檢測，并且在不同腎臟疾病中的表達有相對特異性，因此有望成為診斷IMN的新的無創生物學標志物，并有助于監測IMN病情發展，以及評估療效和預后。

3 MN與ncRNA

3.1 MN與miRNA miRNA是一類廣泛存在于真核生物中的內源性非編碼小分子單鏈RNA，通常由21～25個核苷酸組成，具有高度保守性，其本身不具有開放閱讀框架，通過參與轉錄后基因調控影響機體的病理生理過程，與細胞發育、分化、增殖、凋亡，以及免疫調節、腫瘤發生等有關[13]。

miRNA在人體的各個組織和器官中廣泛表達，一個miRNA可調控多個靶基因，每個靶基因可受多個miRNA調控，從而構成了復雜的miRNA調控網絡。大多數miRNA表達具有組織特異性和發育階段特異性，不同組織中miRNA的表達譜和表達量有差異，且在疾病發生、發展的不同階段表達譜也存在差異。由于miRNA在不同腎臟疾病中存在特異性表達，以及其在不同腎臟疾病中所起的作用不同，調控miRNA表達水平成為治療腎臟疾病的潛在方法。

許多研究已經證明，MN患者的血液、尿液和腎組織中的miRNA表達與正常人群存在差異。Chen等[14]利用高通量測序技術在全基因組范圍內對MN患者組和正常對照組外周血淋巴細胞(PBLC)中miRNA表達譜進行了分析，兩組間共有326個miRNA的表達有顯著差異，包括286個下調的miRNA和40個上調的miRNA。失調的miRNA可能在MN的發病機制中發揮著重要的作用。一項研究[15]發現，MN患者尿液中的miRNA-193a較正常者表達明顯上調，隨著IMN嚴重程度的增加，尿液中miRNA-193a的表達也明顯上調；此外，miRNA-193a的表達與蛋白尿水平顯著相關，miRNA-193a過表達往往也預示著腎臟存活率低。Zhou等[16]的研究結果則表明，MN患者外周血和尿miRNA-195-5p、miRNA-192-3p表達增多，miRNA-328-5p表達減少，其相應的靶基因PPM1A、RAB1A和BRSK1的表達則呈相反的變化，推測這3個基因可能通過炎癥和凋亡相關通路參與MN，如PPM1A和BRSK1可以通過參與MAPK相關的信號途徑，RAB1A可以通過涉及p53信號途徑(CDK1-RAB1A)與MN相關聯，提示這些miRNA及其靶基因作為診斷MN的關鍵生物標志物。

研究[17]發現，MN患者腎組織的miRNA-186表達明顯下調，體外實驗也證明miRNA-186通過Toll樣受體4(TLR4)、P2X7和半胱天冬酶3(caspase-3)參與足細胞凋亡。 Li等[18]的研究發現，miRNA-217通過靶向腫瘤壞死因子超家族成員11(tumor necrosis factor superfamily member 11，TNFSF11)促進足細胞的凋亡，進而參與MN的發病機制。該研究在MN患者的腎臟組織和血漿中均檢測到miRNA-217的表達量明顯下調，同時腎臟組織中TNFSF11基因和蛋白質表達量明顯上調；此外，通過體外轉染miRNA-217干擾載體到足細胞，使miRNA-217表達下調，同時TNFSF11基因表達量明顯上調，證實了TNFSF11是miRNA-217的靶基因，進一步證明了miRNA-217誘導足細胞發生凋亡。這些研究結果提示，miRNA可通過促進足細胞的凋亡導致MN的發生。

3.2 MN與lncRNA lncRNA是一類長度>200個核苷酸的RNA，由RNA聚合酶Ⅱ轉錄而來，不具有編碼蛋白質的能力。lncRNA亦可通過不同的作用機制在基因表達的各個階段發揮重要作用，其調節細胞核內染色質的結構和轉錄，在細胞質中調節 mRNA的穩定性、翻譯和翻譯后修飾(PTM)[19]。lncRNA在表觀遺傳、轉錄，以及轉錄后水平等多層面調控基因的表達，與細胞分化和組織發育、染色體劑量補償、染色質重構、基因組印記等有關，參與動脈粥樣硬化、高血壓、心肌梗死等心血管疾病和多種腫瘤疾病[20]。

近年來，lncRNA與腎臟疾病的研究逐漸增多，lncRNA被報道與多種腎小球疾病相關，如糖尿病腎病、局灶性節段性腎小球硬化、狼瘡腎炎等，并參與了急性腎損傷、CKD、常染色體顯性遺傳多囊腎病、腎結石、尿酸性腎病等多種小管間質疾病[21]。

目前，關于MN與lncRNA的研究較少，被發現表達異常的lncRNA主要為X(染色體)失活特異性轉錄物 (X-inactive specific tran，XIST)。XIST是由X-失活中心(Xic)基因位點轉錄的一種與X染色體失活有關的lncRNA。Huang等[22]發現lncRNAXIST和NEAT1在MN小鼠模型的腎小管上皮細胞和腎小球細胞中表達均顯著上調，并且與MN的嚴重程度呈正相關。脂多糖(lipopolysides, LPS)誘導小鼠腎臟足細胞損傷后，足細胞中XIST水平穩定升高，但NEAT1水平未升高。進一步檢測MN小鼠和腎小球腎炎患者(包括MN)的尿液，發現XIST水平明顯升高，并且尿XIST濃度與MN的嚴重程度呈正相關。進一步研究發現，XIST的調控可能受到翻譯后修飾的控制，因為MN小鼠腎臟中組蛋白27氨基酸三甲基化(H3K27me3)水平顯著下調，染色質免疫沉淀實驗也顯示XIST啟動子區H3K27me3水平下降，提示當MN被誘導時，XIST啟動子H3K27me3的水平降低導致XIST水平升高。因此，尿液中XIST是MN的潛在生物標志物。

足細胞凋亡是MN發生的關鍵過程，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)可誘導足細胞的凋亡。Jin等[23]發現，AngⅡ通過上調TLR4表達促進MN足細胞凋亡，同時再次驗證了在MN腎組織中XIST表達明顯上調，而XIST表達下調可逆轉AngⅡ誘導的足細胞凋亡，同時MN腎組織中miRNA-217的表達顯著下降，TLR4水平升高，由此推測XIST可能是通過miRNA-217負性調節足細胞中TLR4的表達。該實驗也證明了下調XIST表達可激活miRNA-217/TLR4通路改善足細胞凋亡，從而改善MN，為MN的治療提供了有效的靶點。

3.3 MN與circRNA circRNA是一類特殊的閉合環狀的內源性ncRNA，與線性RNA不同，circRNA沒有典型的5’帽子結構和3’polyA尾，故不被核酸外切酶所識別，且其為共價閉合環狀結構，具有很強的穩定性。隨著高通量測序技術的發展，被發現的circRNA的種類逐漸增多，其與多種疾病的關聯也逐漸引起人們的關注，目前已發現circRNA在神經系統疾病[24]、心血管疾病[25]、骨關節炎[26]、糖尿病[27]、自身免疫性疾病[28]，以及各種腫瘤疾病中異常表達。

關于circRNA與腎臟疾病的研究較少，circRNA主要作為miRNA的分子海綿發揮調控作用。Luan等[29]發現，與正常組相比，狼瘡性腎炎(lupus nephritis，LN)患者腎臟中circHLA-C水平較正常組顯著升高，miRNA-150顯著下降，并且circHLA-C與miRNA-150呈負相關趨勢；此外，在circHLA-C和miRNA-150之間顯示了一種完全匹配的結合序列的種子，推測circHLA-C可能是通過調控miRNA-150表達在LN發病機制中發揮重要作用。Hu等[30]在糖尿病模型小鼠和暴露于高糖環境的小鼠系膜細胞中均檢測到circRNA_15698表達上調，同時證實circRNA_15698通過充當miRNA-185的分子海綿，調節TGF-β1蛋白的表達，進而促進細胞外基質(ECM)相關的蛋白質合成。

MN與circRNA的相關報道較少。最近一項研究[31]發現，MN患者外周血中circRNA表達與正常人存在差異，其中circ_101319表達明顯上調，其可能通過調控miRNA參與了MN相關通路，并且在預測MN方面具有良好的靈敏度和強度，有望成為新的MN診斷標志物，為靶向基因治療提供新的工具。另外，Ma等[32]的研究證實，與健康對照組相比，IMN患者血清和尿液外泌體中circRNA均存在差異表達，IMN患者血清外泌體中circRNA的種類減少，以內含子區來源為主。其中89個circRNA的表達有顯著差異，這些circRNA也大多來源于內含子基因區域，包括上調基因49個，下調基因40個，相應基因主要有SNORA25、SNORA51、SNORA31、SNORA75、SNORD112和其他snoRNA；然而，尿液外泌體中的circRNA種類增加，主要表現為外顯子區域來源，60個circRNA的表達具有顯著差異，主要屬于內含子基因區域，其中54個表達上調，6個表達下調。近55%為內含子來源，30%為外顯子來源，15%為基因間區，相應基因主要為SNORA51、SNORA31、SNORA70、SNORA75、SNORD112和其他snoRNA，這些表達異常的circRNA可能參與了IMN的發病機制。

4 總結與展望

總之，ncRNA在MN患者的尿液、血液和腎臟中的異常表達提示其與MN的發病機制相關，又因其表達穩定，為無創檢測，可以作為預測MN的新型生物標志物。對ncRNA的表達進行調控也有可能成為治療MN的新方法。然而，ncRNA參與MN的具體機制仍有待進一步闡明，相信隨著對ncRNA的研究逐漸深入，ncRNA將成為診斷與治療MN的有效工具而造福患者。