苜蓿幼苗對鋁脅迫的生理響應及綜合評價

孫文君, 楊蔚, 許文花, 任健, 韓博, 張冉, 馬向麗

苜蓿幼苗對鋁脅迫的生理響應及綜合評價

孫文君1, 楊蔚2, 許文花1, 任健1, 韓博1, 張冉1, 馬向麗1

(1. 云南農業大學動物科學技術學院, 昆明 650201; 2. 紅云紅河集團昆明卷煙廠, 昆明 650202)

為探討鋁脅迫對苜蓿()幼苗生長和生理特性的影響，對鋁脅迫下苜蓿地上和地下生物量、光合色素及根尖胼胝質含量進行測定，并對根尖結構進行觀察，最后采用隸屬函數分析法對苜蓿耐鋁性進行評價。結果表明，隨著鋁脅迫的增加，苜蓿地上、地下部分生物量呈降低趨勢，低濃度和高濃度鋁脅迫使苜蓿生物量顯著下降(<0.05)；苜蓿的葉綠素含量呈下降趨勢，胼胝質積累量增多；中、高濃度鋁脅迫使根尖胼胝質含量顯著上升。隨鋁脅迫濃度升高，根尖橫切面細胞發生較大變化，尤其在高濃度時，細胞干癟且排列紊亂。隸屬函數分析結果表明，No. 12和No. 18苜蓿材料的耐鋁性較好,可在南方酸性富鋁化土壤中推廣應用。

苜蓿；鋁脅迫；生物量；葉綠素；幼苗；生理

酸性土壤已覆蓋我國長江以南15個省區，總面積約占全國總耕地面積的21%[1]，紅黃壤土地面積大，具脫硅富鋁化成土過程，致使鋁毒害日益嚴重[2]。鋁毒害作為酸性土壤中植物生長發育的主要限制因子[3]，主要以鋁的氧化物或鋁硅酸鹽等固定態鋁的形式存在于自然條件下，可供生物利用價值較小[4]。酸性土壤中鋁毒對植物的危害首先作用于根部，反映于根部形態和生理特征[5]：破壞植物根尖結構，阻礙植物根系對營養元素的吸收，進而使植株地上莖、葉生長發育受抑制，最終致使產量和品質下降或停止生長[6–11]。

苜蓿()是世界上栽培面積最大、栽植最早、經濟價值最高的牧草，有改良土壤、保持水土等作用，因而有“牧草之王”之美譽[12]。苜蓿作為全球最重要的優良豆科牧草，對生態環境的改善起著重要作用，對于牲畜而言，優良的苜蓿干草勝過一切優質的粗飼料[13]，但由于其抗酸鋁能力差，極大地限制了在我國南方地區的種植[5]。

目前，國內外關于鋁對麥類[9]植物、大豆()和水稻()[14]等農作物的毒害和耐鋁毒機理等方面的研究已有較多報道，但對苜蓿耐鋁性研究相對較少；且由于苜蓿材料和耐鋁性評價體系不同，仍未見報道強耐鋁苜蓿資源。因此，研究酸鋁脅迫下苜蓿幼苗生長狀況，篩選耐鋁性品種便顯得十分重要。本研究測定了8份苜蓿屬種質材料在鋁脅迫下的地上和地下部分生物量、葉片光合色素和根尖胼胝質含量，并觀察苜蓿根尖細胞對鋁毒的敏感度，最后采用隸屬函數分析法進行耐鋁性綜合評價，為開展苜蓿耐鋁性研究奠定基礎，亦為后期篩選耐鋁性較強的苜蓿品種提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料來源

前期課題組于云南省各地州進行苜蓿資源調查，收集到云南野生和逸生苜蓿()種質資源30份。通過栽種和生產性能的評價鑒定，篩選出生長狀況良好、且采集地pH值和生存環境差異性較大的8份材料(表1)，并進行繁殖收種，用作耐鋁性鑒定[15]。

表1 云南8份野生和逸生苜蓿材料的采集地點

1.2 培養和處理

在人工智能溫室中，采用12孔育苗盤、珍珠巖育苗，發芽后澆Hoagland完全營養液培育10 d,然后開始鋁脅迫處理；將營養液pH調至4.5，用AlCl3配置成濃度為0、50、100、200、500mol/L的鋁溶液，脅迫處理10 d。試驗期間，隔3 d更換1次營養液。鋁脅迫處理后進行指標測定。

1.3 方法

生物量 隨機選取20株，用濾紙吸干根、莖、葉的水分，置于分析天平分別稱量地上、地下部分鮮質量。

光合色素含量 隨機剪取20株苜蓿新鮮葉片，參照王愛玉等[16]的方法，取0.1 g葉片于95%乙醇中避光浸泡96 h后用分光光度計在470、649、665 nm波長下測定吸光值，計算葉片葉綠素(Chl) a、Chl b、Chl a+b和類胡蘿卜素(Car)的含量，重復3次。

根尖胼胝質含量 參考Kohle等[17]的方法,隨機剪取5株根尖5 mm的根段，經研磨、提取、高溫(80℃)水浴、冷卻后加入苯胺藍顯色液，并吸取上清液與空白液混勻，采用熒光分光光度法測定，計算胼胝質含量，重復3次。

根尖切片的顯微觀察 隨機切取10株苜蓿1 cm長根尖，用200 mL蒸餾水浸泡15 min，再用50 mL 0.2%蘇木精溶液染色20 min，在根尖0~3 mm處切薄片，置于顯微鏡200×物鏡下觀察根尖細胞形態并拍照。

綜合評價 采用隸屬函數法進行。與耐鋁性呈正相關的指標(葉綠素、生物量)用(X)=(X–Xmin)/(Xmax–Xmin)計算隸屬函數值; 與耐鋁性呈負相關的指標(胼胝質含量)用(X)=1–(X–Xmin)/ (Xmax–Xmin)計算隸屬函數值; 用(X)=SX/計算某脅迫濃度下苜蓿各指標的隸屬函數值，式中，(X)為處理指標的耐鋁隸屬函數值；X為處理指標的測定值；Xmax為最大值；Xmin為最小值；X為處理的耐鋁隸屬函數值的平均值；為指標數。

1.4 數據分析

用Excel 2010和SPSS 20.0進行數據統計及作圖，并進行單因素方差分析。

2 結果和分析

2.1 對苜蓿地上、地下生物量的影響

鋁脅迫抑制苜蓿地上生物量的積累(表2)，隨著鋁脅迫濃度的增加，苜蓿地上部分生物量均顯著降低(<0.05)，以500mol/L鋁濃度時最低。其中, No. 11和No. 21苜蓿在鋁濃度為500mol/L時表現較遲鈍，地上生物量降低幅度有所減緩，與200mol/L的差異不顯著(>0.05)。

從表3可見，隨著鋁脅迫濃度的增加，苜蓿的地下部分生物量也呈下降趨勢。低濃度(50mol/L)鋁脅迫時，地下部分生物量比對照顯著下降(< 0.05)。No. 11、No. 18和No. 21苜蓿在≤100mol/L鋁處理時，地下部分生物量顯著降低(<0.05)，而當脅迫濃度為200mol/L時，其地下部分生物量雖有下降，但差異不顯著(>0.05)，這表明3份苜蓿在中、高濃度鋁脅迫下產生了一定抗性。但隨脅迫濃度繼續升高，地下部分的耐受力減弱，所有苜蓿地下部分生物量均呈顯著下降趨勢(<0.05)。

2.2 對葉片葉綠素含量的影響

葉綠素a含量 由圖1可看出，鋁處理抑制苜蓿葉綠素(Chl) a的合成，但不同苜蓿對脅迫的敏感性不同。當鋁濃度為50mol/L時，所有苜蓿葉片的Chl a含量比對照顯著減少(<0.05)，說明苜蓿遭受逆境脅迫能立即響應；隨著鋁濃度的增加，所有苜蓿葉片的Chl a含量與對照間的差異均達顯著水平(<0.05)，且當鋁濃度增至500mol/L時，Chl a含量降至最低；其中，No. 11、No. 12、No. 22和No. 27苜蓿在中、高濃度(100、200mol/L)鋁脅迫時，Chl a含量均無顯著變化(>0.05)。

表2 鋁脅迫對苜蓿地上部分生物量(g)的影響

同行數據后不同字母表示差異顯著(<0.05)。編號見表1。下表同。

Data followed different letters in the same line indicate significant difference at 0.05 level. No. see Table 1. The same is following Tables.

表3 鋁脅迫對苜蓿地下部分生物量(g)的影響

Chl b含量 由圖1可見，隨著鋁脅迫濃度的增加，苜蓿葉片中Chl b含量均有不同程度的下降，但較Chl a含量變化平緩。其中，低濃度(50mol/L)鋁脅迫對No. 3和No. 5苜蓿的Chl b含量有促進作用，比對照升高，但隨脅迫的增強, Chl b含量顯著下降(<0.05)；No. 11和No. 27苜蓿在100mol/L鋁脅迫時，Chl b含量雖有下降，但與50mol/L鋁脅迫的差異不顯著(>0.05); No. 12和No. 21苜蓿受鋁脅迫的Chl b含量均比對照顯著下降，但各脅迫處理間的Chl b含量差異不顯著。

圖1 鋁脅迫對苜蓿光合色素含量的影響。柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

類胡蘿卜素含量 從圖1可見，苜蓿葉片的類胡蘿卜素(Car)含量隨鋁脅迫濃度的增加呈下降趨勢。No. 11、No. 22、No. 27苜蓿葉片的Car含量在50~200mol/L鋁脅迫時下降，但未達顯著差異；No. 12苜蓿受中、高濃度(100~500mol/L)鋁脅迫時，Car含量變化不顯著，說明其對鋁脅迫敏感度較低，存在一定耐受性。

Chl a+b含量 由圖1可知，鋁處理抑制苜蓿葉綠素的合成，鋁脅迫濃度為500mol/L時Chl a+b含量最低，各處理間的差異顯著(<0.05)。但不同材料對不同脅迫濃度的反應敏感性不同，其中，No. 22苜蓿的Chl a+b含量在50~500mol/L鋁脅迫下的差異不顯著(>0.05), No. 11的Chl a+b含量在50~200mol/L鋁脅迫下的差異不顯著(> 0.05)，當脅迫濃度達500mol/L時顯著下降；而No. 12苜蓿葉片Chl a+b含量受≥200mol/L鋁脅迫時的變化不顯著。

2.3 對根尖胼胝質含量的影響

從圖2可見，隨著鋁脅迫濃度升高，苜蓿根尖的胼胝質含量逐漸升高。No. 3、No. 21和No. 22苜蓿的根尖胼胝質含量在中、高濃度(200、500mol/L)鋁脅迫時雖有升高，但差異不顯著(>0.05)，可能是對鋁脅迫產生了一定的適應性。

2.4 根尖的顯微觀察

苜蓿經鋁脅迫處理后，根尖橫切面的細胞變化明顯(圖3)。對照(0mol/L)的苜蓿根尖細胞排列規則且均勻飽滿，各組織結構清晰可辨。經鋁脅迫處理后，細胞排列紊亂，表層細胞大量脫落，且隨脅迫濃度增加而更加明顯。在500mol/L鋁脅迫下,細胞排列不規則且干癟，皮層薄壁組織細胞的細胞壁形態異常。

圖2 鋁脅迫對根尖胼胝質含量的影響

圖3 根尖橫切片(200×)

2.5 綜合評價

采用隸屬函數分析法對8份苜蓿材料的耐鋁性進行評價(表4), 結果表明，在鋁濃度為50mol/L時,苜蓿耐鋁性的排序為: No. 12>No. 18>No. 27>No. 22> No. 3>No. 11>No. 5>No. 21；當濃度為100mol/L時，排序為: No. 12>No. 18>No. 27>No. 22>No.3> No. 11>No. 5>No. 21；當濃度為200mol/L時，排序為: No. 12>No. 18>No. 27>No. 22>No. 3>No. 11> No. 21>No. 5; 當濃度為500mol/L時, 排序為: No. 12>No. 18>No. 22>No. 27>No. 11>No. 3>No. 21> No. 5。可見，No. 12和No. 18苜蓿的表現較好，No. 21和No. 5苜蓿的表現較差。

3 結論和討論

3.1 鋁脅迫抑制苜蓿生長發育

生物量是植株生長狀況的直觀反應，可作為篩選耐性品種的重要依據指標[18]。本研究結果表明,隨鋁脅迫濃度增加，苜蓿生長受到抑制，耐受性減弱，地上、地下部分生物量減少。但脅迫濃度在一定范圍內，生物量的變化趨于平緩，No. 3、No. 21苜蓿在100mol/L濃度脅迫時地上部分生物量的下降幅度比50mol/L的小(表2)；No. 11、No. 18苜蓿在200mol/L脅迫時的地上部分生物量的下降幅度比100mol/L的小(表3)。逆境環境下，植物可通過改變生理適應機制及其形態策略來應對脅迫[19]，其生長受抑制程度會趨于平緩，但當超過該限度時,便會影響植物正常代謝和生長發育進程。嚴重鋁脅迫會阻礙植物代謝，從而影響植物正常生長，減少生物量的累積，這與前人[20–22]的研究結果一致。

表4 苜蓿耐鋁毒性的隸屬值

3.2 鋁脅迫降低光合色素含量

本試驗中，鋁脅迫下8份苜蓿材料葉片的Chl和Car含量均比對照下降，且Chl a含量比Chl b含量減少得更多。肖祥希等[23]對鋁脅迫下龍眼()生長影響的研究也有相同結論。Al3+會破壞苜蓿葉片的光合色素系統，使光合色素合成受阻或加速降解，導致光合色素含量降低，但不同苜蓿對Al3+的耐受性存在差異，因而對不同濃度的鋁脅迫敏感性不同。No. 3、No. 5苜蓿葉片的Chl b含量呈先升后降的變化(圖1)，這與李貞霞等[24]報道辣椒()對鋁脅迫響應結果一致,低濃度鋁脅迫可能促進Chl b的合成，或者是物種對低濃度鋁脅迫反應不敏感，然而隨脅迫濃度加大，則表現出不耐受反應。植物葉片中Car能猝滅不穩定的三線態葉綠素的功能，并具有強氧化作用，對光合膜有潛在作用的單線態氧，從而達到保護受光激發的葉綠素免遭光氧化破壞的效果，以減少光合膜受單線態氧的損傷[23]。有研究表明[19,25–26],當植物處于逆境脅迫環境時，會使體內的Car含量升高。一般認為，抗逆性較好的植物葉片的Car含量普遍較高。但在本試驗中，鋁脅迫下8份苜蓿材料的Car含量均比對照下降，這與張永鋒等[26]的研究結果不一致，這可能是由于植物的抗氧化保護系統的抵抗修復能力存在一定閾值[27]，如果逆境脅迫超過該閾值，其抗氧化保護系統也會降低或喪失保護功能，因此鋁脅迫將導致苜蓿抗逆性的降低。

3.3 鋁毒害誘導苜蓿根尖胼胝質形成

鋁作為一種酸性土壤中較為常見的礦質逆境元素，對植物的毒害在外觀上主要表現為根系伸長受抑制[28]，質外體和細胞壁作為植物最早與鋁接觸的部位，鋁可被表皮或皮層細胞的細胞壁強烈吸附[29]，因此，鋁毒害會影響纖維素的合成，繼而誘導胼胝質的形成[30–31]，并且隨著鋁脅迫濃度的升高，胼胝質含量也增加。這已在多種植物中報道,如燕麥()[32]、小麥()[28,33]、大麥()[30]、玉米()[34–35]、煙草()[36]、菜豆()[37]和挪威云杉()[38]。本研究中，苜蓿材料均在遭受低濃度鋁脅迫時迅速在根尖累積胼胝質，并隨著鋁脅迫濃度升高，胼胝質含量逐漸增高，也有部分苜蓿材料在高濃度鋁脅迫時，根尖胼胝質含量變化不顯著(>0.05)。有研究表明[39–41]，植物在受到機械損傷、生理逆境或病菌感染時，胼胝質合酶催化大量合成胼胝質；并且，鋁誘導胼胝質的形成是一個迅速而又敏感的生理反應[42]，這與本試驗結果一致。鋁誘導根尖胼胝質的形成比根伸長的研究更可靠，因此被廣泛應用在植物耐鋁性機制的研究中。

3.4 鋁脅迫導致苜蓿根尖細胞排列紊亂

一般認為，根尖是鋁毒害的最初作用部位，于外表現在根尖形態的變化，于內則表現為細胞結構的破壞。本試驗中，8份苜蓿材料根尖細胞隨鋁脅迫濃度增加而變化明顯，細胞排列紊亂且表皮細胞受損嚴重，這與Delhaize等[29]對小麥鋁耐性研究結果一致，植物對鋁毒的敏感程度與根系中的鋁含量呈正相關。由于Al3+在根尖細胞壁中大量積累造成破壞，使得細胞結構、排列發生改變。

綜合分析表明，No. 12和No. 18苜蓿在鋁脅迫處理中的表現均較好，有較高的耐受性；其次為No. 27、No. 22、No. 3和No. 11；No. 21和No. 5苜蓿，耐受性較低。

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Physiological Response and Comprehensive Evaluation of Alfalfa Seedlings to Aluminum Stress

SUN Wen-jun1, YANG Wei2, XU Wen-hua1, REN Jian1, HAN Bo1, ZHANG Ran1, MA Xiang-li1*

(1. College of Animal Science and Technology, Yunnan Agricultural University,Kunming 650201, China; 2. Kunming Cigarette Factory of Hongyunhonghe Group,Kunming 650202, China)

In order to understand the effects of aluminum on growth and physiological characteristics of alfalfa () seedlings, the above- and under-ground biomass, contents of leaf chlorophyll and callus in root tips were measured, the structure of root tips was observed, and the aluminum resistance of alfalfa was evaluated using membership function analysis. The results showed that with increment of aluminum concentration, the above- and under-ground biomass of alfalfa decreased, which significantly decreased under low and high aluminum concentrations (<0.05). With increment of aluminum stress, the chlorophyll content of alfalfas dropped, while the accumulation of calluses increased, particularly under middle and high aluminum stress. Under aluminum stress, the cells of root tip had a big changes, which collapsed and in disorder under high aluminum stress. According to comprehensive evaluation, the aluminum resistance of No. 12 and No. 18 was better than that of others, suggesting that they could be applied in acid aluminized soil in southern China.

; Aluminum stress; Biomass; Chlorophyll; Seedling; Physiology

10.11926/jtsb.4238

2020–04–23

2020–07–05

云南省基礎研究計劃面上項目(2019FB044); 云南省重點研發計劃項目(2018BB001-03); 云南省重大科技專項-綠色食品國際合作研究中心項目(2019ZG009)資助

This work was supported by the General Program of Basic Research Plan in Yunnan (Grant No. 2019FB044); the Project of Key Research and Development Plan in Yunnan (Grant No. 2018BB001-03); and the Yunnan Eco-friendly Food International Cooperation Research Center Project of Yunnan Provincial Key Programs (Grant No. 2019ZG009).

孫文君(1992~ ), 女，在讀博士，研究方向: 草地生態與環境。E-mail: 276384152@qq.com

E-mail: xfmaxiangli@126.com