小貫小綠葉蟬EonuCSP14基因克隆與蛋白表達(dá)

周爽爽 劉榮

摘 ? ?要：本試驗(yàn)克隆了小貫小綠葉蟬（Empoasca onukii Matsuda）（原常稱為假眼小綠葉蟬）的化學(xué)感受蛋白基因14（EonuCSP14）（GenBank后登錄號(hào)為4YZPC5X701R），通過(guò)原核表達(dá)體系獲得其重組蛋白，并通過(guò)蛋白純化體系獲得了純蛋白，為小貫小綠葉蟬化學(xué)感受蛋白的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：小貫小綠葉蟬;化學(xué)感受蛋白;基因克隆;蛋白表達(dá)

文章編號(hào)：1005-2690（2021）24-0016-02 ? ? ? 中國(guó)圖書(shū)分類號(hào)：Q966;S435.711 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

小貫小綠葉蟬是茶樹(shù)上為害較廣的害蟲(chóng)，其為害嚴(yán)重威脅著我國(guó)的茶葉產(chǎn)量[1-2]。在關(guān)于害蟲(chóng)的綠色生態(tài)防控技術(shù)研究中，昆蟲(chóng)嗅覺(jué)識(shí)別機(jī)制是研究熱點(diǎn)之一[3]。化學(xué)感受蛋白CSPs是存在于昆蟲(chóng)感器淋巴液中一類水溶性蛋白，分子量較小，其氨基酸序列具有Cys位點(diǎn)數(shù)量及位置保守的特征，是昆蟲(chóng)識(shí)別、運(yùn)輸外界化學(xué)信息物質(zhì)的重要蛋白之一[4]，對(duì)CSPs功能的研究有助于完善昆蟲(chóng)嗅覺(jué)識(shí)別機(jī)制[5]。

1 ? 小貫小綠葉蟬EonuCSP14基因克隆及分析

供試蟲(chóng)源采集于貴州省都勻市（26°13′E，107°30′N）茶園中，于冰上切下其觸角并立即投入液氮保存?zhèn)溆谩Ｓ肐nvitrogen公司的Trizol試劑提取葉蟬觸角總RNA。用試劑盒合成cDNA第一條鏈。通過(guò)NCBI獲得EonuCSP14基因序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物后，由生物公司合成。經(jīng)PCR擴(kuò)增體系得到目的基因產(chǎn)物，電泳后利用AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit回收PCR產(chǎn)物，與pMD-18T Vector一起水浴（42 ℃，4 h），獲取重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單克隆測(cè)序，比對(duì)獲得目的基因克隆體。利用“http：//web.expasy.org/compute_pi/”預(yù)測(cè)等電點(diǎn)、分子量，利用“http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/”預(yù)測(cè)N-末端信號(hào)肽序列。

2 ? 小貫小綠葉蟬EonuCSP14的原核表達(dá)及純化

試驗(yàn)菌株：克隆菌株pMD-18T-EonuCSP14-DH5，pET-32b空載體表達(dá)菌株。

主要儀器：SDS-PAGE蛋白電泳系統(tǒng)，蛋白純化儀，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，酶標(biāo)儀。……