廣西潿洲島3種海參共附生細菌多樣性及其延緩衰老活性分析

銀江林 李蜜 易湘茜 劉永宏 于清武 高程海

摘要：【目的】明確廣西潿洲島海參共附生細菌多樣性，篩選出具有延緩衰老活性的菌株，為挖掘延緩衰老活性的新化合物提供菌種資源?！痉椒ā窟x用9種選擇性培養基對來源于廣西潿洲島的3種海參[異色哈威參（Havelockia versicolor）、玉足海參（Holothuria leucospilota）和方柱翼手參（Colochirus quadrangularis）]共10份樣品進行共附生細菌分離純化，基于16S rRNA測序分析其多樣性，并以秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）為模型評價共附生細菌發酵粗提物的延緩衰老活性?！窘Y果】從廣西潿洲島3種海參中共分離獲得63株共附生菌株，隸屬于3門4綱14目25科35屬，以放線菌綱（Actinobacteria）為優勢菌群，共有31株（占49.21%）;放線菌GXIMD LM0085和GXIMD LM0159有可能為潛在新種，與對應有效發表菌株Kocuria assamensis、K. salsicia的相似性分別為97.38%和97.00%。不同培養基分離獲得的海參共附生細菌在屬類水平上存在明顯的數量差異，以M9培養基分離獲得的菌屬數量最多（19屬28株），P7培養基分離獲得的最少（僅6屬6株）;在篩選確定的35屬細菌中，僅Cobetia和嗜鹽單胞菌屬（Halomonas）在9種培養基均有生長分布，多達13個屬僅在單一的培養基中生長。不同海參分離獲得的共附生細菌數量排序為1#異色哈威參>方柱翼手參>2#異色哈威參>玉足海參，除了玉足海參外，其他3只海參體內的共附生放線菌相對豐度明顯高于體表共附生放線菌相對豐度。線蟲壽命試驗發現，有6株共附生細菌的發酵粗提物能顯著延長秀麗隱桿線蟲壽命（P<0.05），分別是GXIMD LM0037（寡養單胞菌屬）、GXIMD LM0005（鏈霉菌屬）、GXIMD LM0071（副球菌屬）、GXIMD LM0114（寡養單胞菌屬）、GXIMD LM0099（原小單孢菌屬）和GXIMD LM0032（短狀桿菌屬）?！窘Y論】廣西潿洲島海域海參蘊含著多樣性豐富的共附生細菌資源，具有潛在的新物種，且部分菌株具有延緩衰老活性，在延緩衰老活性物質挖掘及新型抗衰老藥物研發方面具有巨大潛力。

關鍵詞：海參;共附生細菌;多樣性;延緩衰老;廣西潿洲島

中圖分類號：S917.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）10-2904-09

Abstract：【Objective】In order to reveal the bacterial diversity and screen out the coepiphytic bacteria for new anti-aging compounds of sea cucumbers from Weizhou Island， Guangxi. 【Method】Nine kinds of media were used to cultivate and separate associated bacteria from 10 samples come from 3 species of sea cucumbers （Havelockia versicolor， Holothuria leucospilota， and Colochirus quadrangularis）. 16S rRNA sequencing was applied to analyze the community diversity. C. elegans models were used to estimate the anti-aging activities of the coepiphytic bacteria metabolites. 【Result】A total of 63 species bacteria were isolated and identified， which belonging to 3 phyla， 4 classes， 15 orders， 25 families and 35 genera. The dominant microflora was Actinobacteria （31 strians， 49%）， and 2 of them （GXIMD LM0085 and GXIMD LM0159） were identified to be putatively novel bacterial species， whose similarities to the published Kocuria assamensis and? K. salsicia were 97.38% and 97.00%， respectively. Differences were found in the number of coepiphytic bacteria isolated from different media at genus level. The M9 medium had the largest number of strains and the richest diversity （19 genera， 28 strains）. However， the P7 medium had the least number （6 genera， 6 strains）. Among the identified 35 genera， only Cobetia and Halomonas were distributed in all 9 growth media， another 13 genus could grow in single medium. The number of symbiotic bacteria isolated from different sea cucumbers was in the order to sort as follows： 1# H. versicolor>C. quadrangularis>2# H. versicolor>H. leucospilota. For these sea cucumbers except H. leucospilota， the relative abundance of symbiotic actinomycetes in vivo were greatly higher than those on their surface. In the anti-aging research， the lifetime of C. elegans was significantly prolonged （P<0.05） by the crude extracts of GXIMD LM0037（Stenotrophomonas）， GXIMD LM0005（Streptomyces）， GXIMD LM0071（Paracoccus）， GXIMD LM0114（Stenotrophomonas），GXIMD LM0099（Promicromonospora），and GXIMD LM0032（Brachybacterium）. 【Conclusion】There are abundant marine coepiphytic bacteria and potential opportunity to discover new species in the sea cucumbers from Weizhou Island. Some bacteria show anti-aging activity， which provides huge potential in the research and development of anti-aging active substances and new anti-aging drugs.

Key words：sea cucumber; coepiphytic bacteria; diversity; anti-aging; Weizhou Island， Guangxi

Foundation item：Joint Fund of National Natural Science Foundation of China （U20A20101）; Guangxi Natural Science Foundation （2020GXNSFGA297002）; Scientific Research Group Foundation of Institute of Marine Drugs， Guangxi University of Chinese Medicine （2018ZD005-A06）; Open Project of Institute of Marine Drugs， Guangxi University of Chinese Medicine （XP019069）

0 引言

【研究意義】目前，我國人口老齡化形勢嚴峻，預計到2030年我國60歲以上老年人口規模將超過3.0億人，到2050年將攀升至4.7億人左右，65歲以上老年人口規模將從2020年的1.7億人上升至3.6億人。因衰老引起的老年病發病率逐年上升，而有效延緩衰老及預防老年病已成為應對人口老齡化的社會焦點。當前，臨床上應用于抗衰老的藥物大多數屬于全合成藥物，其不良反應較多，存在安全隱患（林韜等，2018），因此亟待研發出新型的天然抗衰老藥物。龐大的海洋生態系統孕育著豐富的海洋微生物資源，尤其是高鹽高壓的特殊生境賦予微生物特殊的代謝途徑，易產生結構新穎且生物活性顯著的化合物，在藥物研發領域具有廣泛的應用前景（李韋霖等，2018;游竣驛，2019）。海洋共附生微生物是指與海洋動植物處于共生、共棲、寄生或附生的微生物（繆莉等，2002），海洋動植物作為宿主可為共附生微生物提供良好的生長環境，而共附生微生物代謝產生的各種活性物質有利于促進宿主代謝生長或提供化學保護（Fenical，1993;Jensen et al.，1998），即海洋共附生微生物能為研發延緩衰老藥物提供新來源?！厩叭搜芯窟M展】海參隸屬于棘皮動物門（Echinodermata）海參綱（Holothuroidea），其資源非常豐富，全球有1000多種，我國約有140種，主要分布于熱帶和溫帶地區（姜健等，2004;李妍等，2012）。海參富含增強免疫力、抗腫瘤、抗凝血、抗衰老及抗菌等生物活性物質（張梅秀等，2012），其蘊藏的共附生微生物資源也非常豐富，同樣具有極高的開發利用價值。近年來，已有研究從馬來西亞、印度尼西亞、日本等海域的海參中分離獲得種類繁多的共附生微生物，發現潛在新物種，并證實部分菌株具有抗菌及降解多糖等生物活性（Farouk et al.，2007;Zhang et al.，2012;Wibowo et al.，2019）。國內針對海參共附生微生物的研究相對較少，且主要集中在北方的刺參（Stichopus japonicus）和仿刺參（Apostichopus japoni-cus）。孫奕和陳騳（1989）從刺參不同部位分離出359株細菌和57株酵母菌，并證實刺參不同部位的微生物具有不同的生物活性，包括降解褐藻酸鈉、瓊脂、淀粉、幾丁質、明膠及酪蛋白等。張文姬等（2011）從大連地區冬季和春季的仿刺參腸道中分離獲得141株菌株，經16S rDNA序列測定和系統發育進化分析，發現這些菌株分布于假單胞菌屬（Pseudomonas）、弧菌屬（Vibrio）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、希瓦氏菌屬（Shewanella）及交替假單胞菌屬（Pseudoalteromonas）等10個屬。李智等（2018）從福建吊籠養殖的海參腸道分離出95株菌株，包括31株潛在益生菌、37株潛在致病菌及27株普通腸道菌，從中篩選獲得2株抑菌能力較強的益生菌，并確定其抑菌成分為環脂肽類化合物。李昌明 （2019）從山東威海市的海參腸道內容物中共分離獲得226株菌株，隸屬于4門49屬102種，優勢屬為芽孢桿菌屬，且有16株菌株具有褐藻膠降解能力?！颈狙芯壳腥朦c】潿洲島是廣西北部灣海域最大的島嶼，全島海岸線長26.43 km，其沿岸海域分布的珊瑚礁是我國珊瑚礁的北緣（王欣和黎廣釗，2009;梁文等，2010）。潿洲島海域分布有異色哈威參（Havelockia versicolor）、玉足海參（Holothuria leucospilota）及方柱翼手參（Colochirus quadrangularis）等海參，但至今鮮見針對這3種海參共附生微生物多樣性及其活性分析的相關報道?！緮M解決的關鍵問題】分析廣西潿洲島海域異色哈威參、玉足海參及方柱翼手參的共附生細菌多樣性，篩選出具有延緩衰老活性的菌株，以期為挖掘延緩衰老活性的新化合物提供菌種資源。

1 材料與方法

1. 1 樣品采集

2018年5月在廣西潿洲島海域采集獲得4只海參（圖1），經廣西中醫藥大學劉昕明博士鑒定，分別為2只異色哈威參、1只玉足海參及1只方柱翼手參?；铙w海參采集后放入裝有適量海水的取樣箱，及時送回實驗室進行處理。以無菌水清洗干凈海參體表，利用無菌手術剪在超凈工作臺中對海參進行解剖，剪取其腸道、胃和表皮組織各2.0 g，分別加入3.0 mL無菌水充分研磨均勻;將研磨得到的液體轉移至無菌EP管中，即為海參樣品原液，樣品信息如表1所示。

1. 2 試驗材料

野生型秀麗隱桿線蟲（N2）、尿嘧啶缺陷型大腸桿菌（OP50）由廣西科學院汪斌博士惠贈。Chelex-100樹脂及2×Easy Taq SuperMix購自美國Bio-Rad公司;PCR引物（27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）購自北京全式金生物技術股份有限公司;二甲基亞砜（DMSO）購自西隴科學股份有限公司;其他有機試劑均為國產分析純。細菌分離培養基：M5（海藻糖—脯氨酸培養基）、M7（改良ISP5培養基）、M9（精氨酸—天冬酰胺培養基）、M10（葡萄糖—水解酪素培養基）、M11（棉籽糖—組氨酸培養基）、P7（酪氨酸—天冬酰胺培養基）、P3（燕麥培養基）、AGG（改良高氏培養基）及2216E培養基;細菌純化與保藏培養基：改良ISP2固體培養基（酵母提取物2.0 g，麥芽提取物2.0 g，葡萄糖2.0 g，瓊脂15.0 g，海水1000.0 mL）;細菌發酵培養基：改良ISP2液體培養基。主要儀器設備：超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）、PCR儀（美國Bio-Rad公司）、凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）、HVE-110高壓滅菌鍋（日本Hirayama公司）、體視顯微鏡（日本Olypus公司）及恒溫培養箱（上海精宏實驗設備有限公司）。

1. 3 試驗方法

1. 3. 1 細菌分離、純化與保藏 采用梯度稀釋法，以無菌水將海參樣品原液制備成10-3和10-4的稀釋液，涂布于9種細菌分離培養基上，置于28 ℃恒溫培養箱中培養3～7 d;根據菌落顏色、大小及表面是否光滑等形態特征，挑選形態差異的菌落接種于改良ISP2固體培養基上進行重復劃線分離，以獲得單一菌落，記錄菌落形態特征。純化菌株以20%（v/v）甘油保藏于 -80 ℃超低溫冰箱內。

1. 3. 2 細菌分子鑒定 參考周雙清等（2010）的方法，以Chelex-100法提取的細菌基因組DNA為模板，以27F和1492R為引物，進行16S rRNA序列擴增。PCR反應體系25.0 μL：DNA模板1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，2×Easy Taq SuperMix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行34個循環;72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至上海美吉生物醫藥科技有限公司廣州分公司測序;運用DNAStar進行基因序列信息整理，基于EzBioCloud數據庫（https：//www.ezbiocloud.net/）進行序列比對分析。

1. 3. 3 細菌發酵粗提物制備 參考覃媚等（2016）的方法，將分離獲得的菌株接種至裝有ISP2液體培養基（300.0 mL）的三角瓶中，28 ℃下搖床（180 r/min）發酵培養7 d，發酵液用等量體積的乙酸乙酯萃取3次，取乙酸乙酯相經旋轉蒸發儀減壓濃縮，所得浸膏干燥后即為細菌發酵粗提物。

1. 3. 4 細菌發酵粗提物延緩衰老活性檢測 以秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）為模型，通過線蟲壽命試驗評價細菌發酵粗提物的延緩衰老活性（Lakowski and Hekimi，1998）。產卵期的線蟲以M9緩沖液清洗，無菌離心后棄上清液，按1∶3的比例加入裂解液（5 mol/L NaOH+5% NaClO，2∶1混勻），振蕩離心收集沉淀;沉淀以M9培養基清洗3次，轉移至含OP50的NGM培養基中，20 ℃培養48 h后即獲得L4期線蟲。細菌發酵粗提物用1% DMSO配制成500 μg/mL的藥液，以1% DMSO為空白對照，將L4期線蟲挑至添加有50.0 μL藥液的NGM培養基中培養，每組設2個板，每板挑取20條L4期線蟲，培養當天記為0 d。隔天對培養線蟲的生存及死亡情況進行觀察記錄，每2 d將線蟲轉移至新的含藥NGM培養基中，直至線蟲全部死亡。試驗數據采用SPSS 22.0進行統計分析。

2 結果與分析

2. 1 海參共附生細菌的分離鑒定結果

細菌分離純化后，根據菌落顏色、大小及表面是否光滑等形態特征進行排重，共獲得129株分離菌株，經16S rRNA序列比對分析，最終得到63株菌株，隸屬于3門4綱14目25科35屬（表2）。在綱分類水平上，放線菌綱（Actinobacteria）有31株17個屬，γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）有13株9個屬，α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）有7株5個屬，芽孢桿菌綱（Bacilli）有12株5個屬?？梢姡啪€菌綱為優勢菌群，包含考克菌屬（Kocuria）4株，鏈霉菌屬（Streptomyces）、諾卡氏菌屬（Nocardia）、微桿菌屬（Microbacterium）和短桿菌屬（Brevibacterium）各3株，短狀桿菌屬（Brachybacterium）、紅球菌屬（Rhodococcus）和小單孢菌屬（Micromonospora）各2株， 短小桿菌屬（Curtobacterium）、分支桿菌屬（Mycobacterium）、假諾卡菌屬（Pseudonocardia）、兩面神菌屬（Janibacter）、壤霉菌屬（Agromyces）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、纖維微菌屬（Cellulosimicrobium）、原小單孢菌屬（Promicromonospora）及戈登菌屬（Gordonia）各1株。

根據16S rRNA序列最高相似性小于98.00%菌株為潛在新物種的歸類原則（Stackebrandt and Ebers，2006），從廣西潿洲島3種海參樣品中分離獲得的放線菌GXIMD LM0085和GXIMD LM0159有可能為潛在新種，與對應有效發表菌株K. assamensis、K. salsicia的相似性分別為97.38%和97.00%。

2. 2 不同培養基分離的海參共附生細菌分布情況

利用9種選擇性培養基進行海參共附生細菌分離，結果（圖2）發現在屬類水平上存在明顯的數量差異。其中，M9培養基分離獲得的細菌種屬數量最多，共19屬28株;P7培養基分離獲得的細菌種屬數量最少，僅有6屬6株。在分離獲得的17屬31株放線菌中，M5培養基獲得的放線菌種屬數量最多，共9屬11株，分離效果最優;P7培養基分離獲得的放線菌種屬數量最少，僅得到1株放線菌。在最終篩選確定的35屬細菌中，僅Cobetia和嗜鹽單胞菌屬（Halomonas）在9種培養基均有生長分布，多達13個屬僅在單一的培養基中生長，其中，纖維微菌屬、原小單孢菌屬、戈登菌屬和糖多孢菌屬僅生長于M5培養基，交替單胞菌屬（Alteromonas）、假諾卡菌屬、假芽胞桿菌屬（Fictibacillus）和動性球菌屬（Planococcus）僅分離自M9培養基，腸桿菌屬（Enterobacter）和短小桿菌屬僅分離自M11培養基，分支桿菌屬、Pseudovibrio、微小桿菌屬（Exiguobacterium）則分別分離自P3培養基、AGG培養基和2216E培養基。可見，部分菌屬對培養基具有高度的偏好性，采用多種培養基相結合可篩選獲得多樣性更豐富的海參共附生細菌。

2. 3 不同海參共附生細菌多樣性分析結果

不同海參及其組織樣品分離獲得的共附生細菌種類和數量也存在明顯差異（圖3和圖4）。不同海參分離獲得的共附生細菌數量排序為1#異色哈威參>方柱翼手參>2#異色哈威參>玉足海參，不同海參組織樣品分離獲得的共附生細菌數量排序則表現為H1-2>H4-2=H2-1>H1-3>H1-1>H3-1=H3-2=H4-3>H4-1>H2-2。由此可見，以來自海參胃部的可培養共附生細菌最多，其多樣性高于腸道和表皮組織，2#異色哈威參和玉足海參因個體太小未能獲取胃部樣品，因此其可培養共附生細菌多樣性低于1#異色哈威參和方柱翼手參。

海參體內存在大量共附生放線菌（Wang et al.，2018）。Wibowo等（2019）利用Illumina MiSeq分析2只海參共附生細菌多樣性時發現，海參內部放線菌相對豐度分別是體表的3.6和9.6倍。本研究結果表明，除了玉足海參外，其他3只海參體內的共附生放線菌相對豐度也明顯高于體表共附生放線菌相對豐度，其中1#海參體內放線菌相對豐度是體表的5.33倍，2#海參體內放線菌相對豐度是體表的6.00倍，方柱翼手參體內放線菌相對豐度是體表的8.00倍。

2. 4 海參共附生細菌發酵粗提物延緩衰老活性分析結果

將分離到的海參共附生細菌分成2組，進行發酵粗提物延緩衰老活性檢測，結果（圖5）顯示，有6株菌株的發酵粗提物能顯著延長秀麗隱桿線蟲壽命（P<0.05），分別是GXIMD LM0037（寡養單胞菌屬）、GXIMD LM0005（鏈霉菌屬）、GXIMD LM0071（副球菌屬）、GXIMD LM0114（寡養單胞菌屬）、GXIMD LM0099（原小單孢菌屬）和GXIMD LM0032（短狀桿菌屬），其發酵粗提物培養的秀麗隱桿線蟲壽命分別較空白對照組延長31.50%、31.13%、26.88%、18.81%、18.79%和18.50%。

3 討論

近年來，許多學者通過優化培養基配方以期獲得多樣性更豐富的可培養微生物。Zhang等（2012）綜合考慮海洋微生物生長環境的pH和鹽度，設計出13種培養基用于分析玉足海參腸道菌群多樣性。趙雅慧等（2018）基于原位環境的營養組成，設計不同營養物質及碳氮源組成的5種培養基，用于對比分析普通紅樹和鹽堿地紅樹根際土壤細菌的多樣性。本研究選用9種培養基對廣西潿洲島海參共附生細菌進行分離純化，結果發現，以M9培養基分離獲得的細菌種屬數量最多，分離效果最佳;而M5培養基分離獲得的放線菌數量最多，多樣性最豐富，與姜舒等（2020）從真紅樹中篩選內生放線菌的結果一致。在35個菌屬中，有13個屬僅在單一的培養基中生長，說明不同微生物對培養基具有明顯的偏好性，采用多種培養基相結合能滿足不同微生物的生長需求，進而提高海參共附生細菌的篩選效率（Dupont et al.，2014）。隨著宏基因組等高通量測序技術的發展，研究人員雖然通過免培養技術也能全面了解微生物多樣性，但要深入研究微生物的生理特征、代謝產物及活性等內容，仍需通過可培養法獲得純培養菌株。因此，開發設計新型培養基、優化培養基配方、改進微生物分離方法仍是開發利用微生物資源及發掘具有生物活性微生物新物種的重要途徑。

本研究利用多種選擇性培養基對廣西潿洲島海參共附生細菌進行分離純化，通過16S rRNA測序分析，共獲得63 株共附生細菌，隸屬于3門4綱14目25科35屬，以放線菌綱（49.21%）為優勢菌群，且發現有2株考克菌屬菌株（GXIMD LM0085和GXIMD LM0159）為潛在新種。Zhang等（2012）研究發現，日本海域海參共附生細菌以放線菌門、變形桿菌門及厚壁菌門為主，其中厚壁菌門（56.7%）為優勢菌門;Wibowo等（2019）對印度尼西亞海域2種海參共附生細菌進行多樣性分析時發現，主要門類為放線菌門、變形桿菌門及厚壁菌門，以放線菌門（49.6%）為優勢菌門。優勢菌門間的差異可能與海參來源、食用沉積物及生長階段有關（成功，2011;Gao et al.，2014;Wang et al.，2018）。海洋放線菌易產出潛在的活性物質，大量存在海洋沉積物中，而海參主要以生長環境的沉積物為食，其體內及體表共附生大量放線菌，是挖掘新型活性化合物的重要資源庫。

此外，本研究以秀麗隱桿線蟲為模型探究海參共附生細菌發酵粗提物的延緩衰老活性，結果發現，有6株菌株的發酵粗提物能顯著延長線蟲壽命。其中，GXIMD LM0037（寡養單胞菌屬）、GXIMD LM0005（鏈霉菌屬）發酵粗提物對秀麗隱桿線蟲壽命延長了31.50%和31.13%，與100 μmol/L白藜蘆醇（30.08%）及80 mg/L鐵皮石斛多糖（30.54%）對線蟲壽命的延長效果相當（王婷婷等，2015;李海春，2016）;GXIMD LM0071（副球菌屬）發酵粗提物對秀麗隱桿線蟲壽命延長了26.88%，略高于100 μmol/L牛蒡木脂素及25 mg/L桑葉多酚的效果（Shan and Michael，2015;Zheng et al.，2014）;GXIMD LM0114（寡養單胞菌屬）、GXIMD LM0099（原小單孢菌屬）及GXIMD LM0032（短狀桿菌屬）發酵粗提物分別延長秀麗隱桿線蟲18.81%、18.79%和18.50%的壽命，略低于45 μmol/L淫羊藿苷（20.67%）及20 μmol/L淫羊藿次苷Ⅱ（20.00%）對線蟲壽命的延長效果（蔡外嬌，2012）。但具體是活性菌株發酵粗提物中的何種成分對秀麗隱桿線蟲具有延緩衰老作用，尚有待進一步驗證。

4 結論

廣西潿洲島海域海參蘊含著多樣性豐富的共附生細菌資源，具有潛在的新物種，且部分菌株具有延緩衰老活性，在延緩衰老活性物質挖掘及新型抗衰老藥物研發方面具有巨大潛力。

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（責任編輯 蘭宗寶）