松針蛋白功能性質及體外消化的研究

邊林林，劉慧瑩，杜 娟，劉 丹，劉文君，廖 群*

（1.江中藥業股份有限公司，江西南昌 330000；2.江西省特殊醫學用途配方食品重點實驗室，江西南昌 330000；3.中藥矯味（掩味）和感官評價關鍵技術重點實驗室，江西南昌 330000）

松針(pine needle)是松科植物油松，又名短葉松、紅皮松。松針提取物含有豐富的活性物質，如揮發油、多糖、胡蘿卜素、維生素C、維生素E和氨基酸等多種成分。現代藥理實驗研究表明松針提取物具有降血脂、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗突變及保肝等諸多方面的生理活性[1-2]。當前對松針的研究報道主要集中于有效物質提取、多糖的抗氧化性以及精油的作用等研究［3-5］，趙學麗等［6］研究了紅松松針揮發油中氨基酸的組分和化合物成分，17種游離氨基酸中必需氨基酸占總氨基酸含量的46%；董朱和孫海軍[2,7]等分別總結了松針的抗腫瘤及抗衰老作用機制；朱曉娟等［8］從分子水平探究了松針多糖和葛根黃酮組合對3T3-L1脂肪細胞分化及脂質代謝的影響，而對松針蛋白的研究，特別是針對蛋白的溶解性、乳化性及起泡性等功能性質的研究較少。本研究以松針蛋白為原料，研究了pH、溫度和NaCl濃度對松針蛋白功能性質的影響及松針蛋白消化情況，為今后松針蛋白在食品工業中的推廣應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

松針蛋白（蛋白質含量80%），由大興安嶺林格貝寒帶生物科技股份有限公司提供。一級大豆油（市售）；胃蛋白酶、胰蛋白酶、葡萄糖氧化酶，美國Sigma公司；十二烷基硫酸鈉、氯化鈉、鹽酸、醋酸鈉、氯化鈣、95%乙醇、98%濃硫酸、氫氧化鉀和氫氧化鈉均為分析純。

1.2 儀器與設備

MS204分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；320 pH Meter pH計（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；LHH-500GSD綜合性藥品穩定性試驗箱（上海藍豹試驗設備有限公司）；FOSS8400凱氏定氮儀（Kjeltec）；T10均質機（德國IKA）；XMTE-208電熱恒溫水浴鍋（國華企業集團有限公司）；UV-1800紫外可見分光光度計（SHIMADZU）；ALLegra X-30臺式冷凍離心機（BECKMAN COULTER）。

1.3 實驗方法

1.3.1 溶解性

準確稱取一定量的松針蛋白樣品，測定樣品中蛋白含量（C0），然后用純化水將松針蛋白配制成0.1%（m/v）的溶液，分別在不同溫度（20 、30 、40 、50 、60 、70 、80 、90 ）或調節至 一 定 pH（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）和鈉離子強度（0.5 mol/L、1.0 mol/L、1.5 mol/L、2.0 mol/L、2.5 mol/L）下磁力攪拌30 min，6 500 r/min離心20 min，取上清液，采用凱氏定氮儀測定上清液中蛋白質含量，計算松針蛋白的溶解性[9]。

1.3.2 持水性

準確稱取1.5 g松針蛋白于50 mL離心管中，加入40 mL純化水，渦旋振蕩5 min，分別于20 、30 、40 、50 、60 、70 、80 和90 恒溫水浴30 min，每隔10 mim振搖一次，3 500 r/min離心30 min，移除上清液，稱量離心管的質量，計算松針蛋白的持水性[10]。

1.3.3 持油性

準確稱取1.5 g松針蛋白于50 mL離心管中，加入15 mL大豆油，渦旋振蕩15 min，分別于20 、30 、40 、50 、60 、70 、80 和90恒溫水浴30 min，每隔10 min振搖一次，3 500 r/min離心30 min，移除上清液，稱量離心管的質量，計算松針蛋白的持油性[11]。

1.3.4 乳化性及乳化穩定性

將松針蛋白用純化水配制成3%（m/v）的溶液，調節至一定pH（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）和鈉離子強度（0.5 mol/L、1.0 mol/L、1.5 mol/L、2.0 mol/L、2.5 mol/L）下磁力攪拌30 min，取50 mL加入15 mL大豆油，用均質機乳化2 mi（n30 000 r/min），迅速從底部吸取50 μL與5 mL 0.1%的SDS溶液充分混合，在波長500 nm處測定其吸光值（A0），10 min后再次從底部吸取50 μL按上述步驟測定其吸光值（A1），松針蛋白的乳化活力指數（EAI）和乳化穩定性指數（ESI）[12]。計算如下：

式中：0.33為大豆油體積分數，V/V；C0為蛋白質的濃度，g/mL。

1.3.5 起泡性及泡沫穩定性

將松針蛋白用純化水配制成3%（m/v）的溶液，分別調節至一定pH（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）和 鈉 離 子 強 度（0.5 mol/L、1.0 mol/L、1.5 mol/L、2.0 mol/L、2.5 mol/L）下用均質機均質2 min（30 000 r/min），記錄泡沫和液體總體積（V1），均質前溶液體積（V0），靜置60 min，再次記錄此時泡沫體積（V60）。計算松針蛋白的起泡性（FC）和泡沫穩定性（FS）[13]。

1.3.6 體外消化率

松針蛋白消化率采用胃蛋白酶-胰蛋白酶兩步法及參照HJ Chung[15]的方法加以改進。準確稱取0.1 g松針蛋白于試管中，加入2 mL的HCI溶液，渦旋振蕩10 min后，使用1 mol/L的HCI調溶液pH為3.0，添加2.5×104U/mL胃蛋白酶，將試管置于電熱恒溫水浴鍋中37 、270 r/min條件下體外胃消化，每間隔0 min、30 min、60 min、90 min和120 min取0.1 μL樣品，然后使用1 mol/L的NaOH調節樣品pH為7.0，滅酶。對120 min所得消化液調節pH為7.0，添加1.5×104U/mL胰蛋白酶，持續再消化30 min、60 min、90 min、120 min后滅酶取樣，于波長500 nm處測定吸光值，計算松針蛋白的消化率[14-15]。

2 結果與討論

2.1 松針蛋白的溶解性

松針蛋白在不同pH、溫度和NaCI濃度下溶解性變化的考察結果如圖1所示。由圖1可知，松針蛋白在pH為6時溶解性最小，當pH小于6時，其溶解性隨著pH升高呈下降趨勢，當pH大于6時則隨pH的增加呈上升。這是因為松針蛋白的等電點接近6.0，此時蛋白表面所帶電荷被中和，降低了蛋白質與水的結合能力，故而溶解性最小；當pH遠離等電點時，蛋白表面電荷增加，溶解性增大。

圖1 pH對松針蛋白溶解性的影響

由圖2可見，隨溫度的升高松針蛋白的溶解性呈上升趨勢，溫度為80 時達到最大值，超過80后溶解度降低可能是由于溫度的升高肽鏈舒展結構發生變化，大量疏水性基團暴露在蛋白質表面，蛋白質發生了熱變性，蛋白質溶解性下降［16-17］。

圖2 溫度對松針蛋白溶解性的影響

由圖3可見，松針蛋白的溶解性在NaCI濃度為1 mol/L時達到最大，隨著NaCI濃度的增大，由于鹽析作用使松針蛋白的溶解性下降。

圖3 NaCl濃度對松針蛋白溶解性的影響

2.2 松針蛋白的持水性和持油性

松針蛋白在不同溫度下持水性和持油性的考察結果如圖4所示。松針蛋白的持水性隨溫度的升高在60 達到最大值，持續升溫后持水性反而降低。這可能是由于溫度的上升有利于蛋白質分子的解離和伸展，并且促進了蛋白質分子和水分子的相互作用［18］；但隨著溫度的進一步升高，蛋白質發生變性，分子內部的非極性基團大量暴露，削弱了蛋白質與水之間的相互作用［19］，故而持水性反而出現下降趨勢。

圖4 溫度對松針蛋白持水性和持油性的影響

松針蛋白持油性隨著溫度的變化先升高后降低，這可能是由于在溫度逐步升高過程中蛋白質分子逐漸伸展，肽鏈伸展后與加溫處理的油中小分子相互結合［20］，松針蛋白的持油性呈上升趨勢；而隨著溫度的進一步升高，其持油性反而出現下降，則可能是因為溫度升高導致油的流動性增強，黏度降低，蛋白質變性，削弱了蛋白質與油的相互作用。

2.3 松針蛋白乳化性及乳化穩定性

松針蛋白在不同pH和NaCl濃度下乳化性和乳化穩定性變化考察結果如圖5所示。由圖5可知，當pH為6.0時松針蛋白的乳化性和乳化穩定性均處于最低值，這可能是松針蛋白接近等電點時，溶解性最小（圖1可見），參與乳化的蛋白相對較少，乳化性及乳化穩定性達到最低，遠離等電點時蛋白質的溶解度增大，參與乳化作用的蛋白質分子就越多，從而促進油／水界面之間薄膜的形成，且帶有電荷，防止或減緩液滴絮凝和聚結，乳化性和乳化穩定逐漸上升[21]。

圖5 pH對松針蛋白乳化性和乳化穩定性的影響

圖6可見，隨NaCI濃度的增加，乳化性和乳化穩定性呈下降趨勢，NaCI濃度為0.5 mol/L時乳化性和乳化穩定性數值最大，這可能是松針蛋白在較低離子強度下溶解性較大，隨著離子強度的增加，乳化性及乳化穩定性顯著降低，因為較低離子強度易于催化蛋白質聚合，使單位面積油水界面上蛋白質聚合物的數量增加，減低了油水界面表面張力，乳化性增加[22]。但隨著離子強度的增加影響了酶活，使單位面積油水界面上蛋白質聚合物的數量減少，乳化性和乳化穩定性降低[23]。

圖6 NaCI濃度對松針蛋白乳化性和乳化穩定性的影響

2.4 松針蛋白起泡性及起泡穩定性

松針蛋白在不同pH、溫度和NaCI濃度下起泡性和起泡穩定性變化的結果如圖7所示。由圖7可知，松針蛋白起泡性和起泡穩定性在接近等電點時數值呈下降趨勢，當遠離等電點時，發泡力明顯提高。蛋白質在其等電點具有最低的自由電荷，分子自身容易相互聚集，從而發生沉淀。通過調節pH，可以使蛋白質的分子結構及功能性質發生改變。經酸調改性的蛋白質大都具有較好的起泡性、泡沫穩定性[24]。

圖7 pH對松針蛋白起泡性和起泡穩定性的影響

由圖8可知，松針蛋白的起泡性在50 時達到最高值，超過50 后呈下降趨勢，可能是因為溫度升高增加了蛋白質的溶解，樣品中可溶性物質增多導致。

圖8 溫度對松針蛋白起泡性和起泡穩定性的影響

由圖9可知，NaCl濃度在1.0 mol/L時起泡性和起泡穩定性能力最強，隨之出現降低趨勢。因為NaCl濃度能夠影響蛋白質的溶解性、黏度、伸展和聚集，從而改變了起泡性和起泡穩定性[25]。

圖9 NaCl濃度對松針蛋白起泡性和起泡穩定性的影響

2.5 松針蛋白消化率

采用體外消化試驗考察了松針蛋白消化情況，結果如下圖所示。由圖10可知，松針蛋白在胃蛋白酶消化階段前30 min時消化率上升較快，之后消化率上升減慢，在胰蛋白酶消化階段消化率緩慢升高，在總消化時間180 min時達到78.6%，而后再隨時間的增加呈緩慢下降趨勢，蛋白質在體內主要是在胃腸消化，胃蛋白酶和腸蛋白酶都為內切酶，胃蛋白酶首先將食物中的蛋白質分解成肽段，再由小腸中胰腺分泌的胰蛋白酶進行消化分解。在胃液消化過程中，蛋白消化不完全，在腸內得到進一步消化。研究中消化率受很多因素的影響，消化率與消化時間、蛋白的性質也有密切關系[26-28]。李倩等[29]研究發現加熱對乳清蛋白變性率呈正相關，消化時間越長，則變性率越大，消化率越低。本文中未對松針蛋白變性后消化率進行研究，后續有待進一步深入研究。

圖10 不同時間段松針蛋白消化率的變化情況

3 結論

（1）松針蛋白溶解性隨溫度升高呈上升趨勢，溫度為80 時達到最大值，持水性和持油性受溫度的影響，在60 達到最大值。說明適當的加溫可增加松針蛋白的溶解性、持水性和持油性。

（2）不同pH條件下，松針蛋白起泡性和起泡穩定性遠離等電點時起泡性和起泡穩定性較好，接近等電點數值呈下降趨勢，松針蛋白pH遠離等電點時，相應地溶解性也隨之增大，這說明松針蛋白的乳化性和乳化穩定性和溶解性受等電點的影響較大。

（3）松針蛋白的乳化性隨著NaCl濃度升高而降低，當NaCl濃度≥1 mol/L時，NaCl濃度升高時，松針蛋白的溶解性、起泡性呈下降趨勢，說明NaCl濃度可以改變松針蛋白的溶解度、乳化性和起泡性。

（4）研究中消化率受很多因素的影響，消化率與消化時間、蛋白的性質也有密切關系，后續有待進一步深入研究。