維生素C壓片糖果微生物限度檢驗方法適用性試驗

程琳琳，呂煥鵬，黃美山，郭 楊

（無限極（營口）有限公司，遼寧營口115010）

維生素C壓片糖果，精選6大植物成分，富含天然維生素C（主要來源于針葉櫻桃和刺梨），是一款具有莓果風味的預包裝片劑類食品。CNASCL01-A001：2018《檢測和校準實驗室能力認可準則 在微生物檢測領域的應用說明》7.2.1.5中有明確規定，標準方法在引入檢測之前，實驗室應證實能夠正確地運用這些方法。在進行方法證實時，樣品的選擇最好采用自然污染樣品或人為添加目標微生物的樣品進行方法證實試驗[1]。本文人為加入標準菌株，計數方法試驗通過計算回收率比值；控制菌方法試驗，通過定性檢測目標菌的方式，驗證維生素C壓片糖果適宜的微生物限度檢驗方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

GR85DR型高壓蒸汽滅菌鍋（廈門致微）、BSC-1000IIA2型生物安全柜（蘇凈安泰）、EB-250B型生化培養箱（安勝科技）、KB240型霉菌培養箱（BINDER）、PRACTUM1102-1CN型電子天平（Sartorius）。

1.2 培養基與試劑

平板計數瓊脂（PCA）、孟加拉紅培養基（虎紅）、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）、煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）、緩沖蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸鈉煌綠增菌液基礎（TTB）、亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液、木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、7.5%氯化鈉肉湯、Baird-Parker瓊脂平板、血瓊脂平板（廣東環凱微生物科技有限公司）。

1.3 試驗菌株

金黃色葡萄球菌ATCC 6538 F3、銅綠假單胞菌CMCC（B） 10104 F3、枯草芽孢桿菌CMCC（B）63501 F3、大腸埃希氏菌ATCC 25922 F2、黑曲霉CMCC（F） 98003 F4、白色念珠菌ATCC 10231 F2、鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14208 F2。

1.4 試驗樣品

維生素C壓片糖果：批號21F24ADH01。

1.5 試驗原理

計數方法試驗是通過加入一定數量級的標準菌株到樣品系列稀釋液中，按照檢驗流程進行檢測，計算回收率，參考2020版《中國藥典》中1105《非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法》的要求，試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值與菌液對照組菌落數的比值應在0.5～2范圍內[2]。若各試驗菌的回收試驗均符合要求，可確認所用的供試液制備方法與計數方法適合該供試品的檢驗，反之需要分析原因，調整方法進一步驗證。

控制菌方法試驗通過加入一定量的標準菌株到樣液中，按照控制菌檢測方法若檢出試驗菌，則該產品可按此控制菌檢測方法進行檢測；若未檢出試驗菌，則應選擇適宜的方法消除樣品的抑菌性，并對方法重新驗證。

1.6 計數方法試驗

1.6.1 菌懸液制備

取凍存菌株：將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、白色念珠菌、大腸埃希氏菌復蘇后，制備成適宜濃度的菌懸液，備用。

1.6.2 供試液制備

無菌稱取維生素C壓片糖果25 g，加入225 mL 0.85%無菌生理鹽水稀釋液中完全溶解后，加入10 mL 1 mol/L NaOH混勻，得到10-1樣液；同法制備10-2、10-3稀釋度樣液，分裝滅菌小試管中，每管9 mL，備用。

1.6.3 試驗流程

分3組進行試驗，計算回收率。

（1）試驗組。分別取1 mL“1.6.1”制備的菌懸液加入到各稀釋級供試液中，混勻后，分別接種1 mL到無菌培養皿中，每一稀釋度2個平行培養皿，其中，加入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌菌懸液的樣品稀釋液傾注平板計數瓊脂，置于36 培養48 h，菌落計數。加入黑曲霉、白色念珠菌菌懸液的樣品稀釋液傾注孟加拉紅培養基，置于28 培養5 d，菌落計數。加入大腸埃希氏菌菌懸液的樣品稀釋液傾注VRBA瓊脂，置于36 培養24 h，菌落計數。經證實，實驗根據陽性比例計算樣品中大腸菌群數。

（2）菌液組。取“1.6.1”制備的菌懸液加入無菌培養皿中，測試試驗菌的菌落數，培養溫度及時間與試驗組一致。

（3）供試品對照組。取“1.6.2”中各稀釋級的樣品稀釋液，測試樣品本身菌落數，培養溫度及時間與試驗組一致。

1.7 控制菌方法試驗

1.7.1 菌懸液制備

取凍存菌株金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌復蘇后，按要求制備成適宜菌懸液，備用。

1.7.2 試驗流程

分3組進行試驗，觀察結果。

（1）試驗組。分別無菌稱取維生素C壓片糖果于7.5%氯化鈉肉湯和BPW增菌液中，加入“1.7.1”制備的菌懸液，按照金黃色葡萄球菌、沙門氏菌國標檢測方法進行試驗，觀察結果。

（2）菌液組。直接取“1.7.1”制備的菌懸液加入7.5%氯化鈉肉湯和BPW增菌液中培養，按照國標方法進行檢測，觀察結果。

（3）供試品對照組。分別無菌稱取維生素C壓片糖果于7.5%氯化鈉肉湯和BPW增菌液中，按照國標方法進行檢測，觀察結果。

2 結果與討論

2.1 計數方法試驗

由表1可知，經pH調節后，維生素C壓片糖果不同稀釋度供試品對銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉、大腸埃希氏菌基本沒有抑制，回收比值均在0.5～2范圍內。

表1 計數方法試驗結果

2.2 控制菌方法試驗

由表2可知，維生素C壓片糖果按照國標方法檢測金黃色葡萄球菌、沙門氏菌時，試驗組與菌液組均檢出金黃色葡萄球菌和鼠傷沙門氏菌，樣品對照組未檢出金黃色葡萄球菌和鼠傷沙門氏菌，試驗組未出現目標菌被抑制現象。

表2 控制菌方法試驗結果

3 結論

經驗證 GB 4789.2—2016[3]、GB 4789.15—2016[4]、GB 4789.3—2016（第二法）[5]、GB 4789.10—2016[6]、GB 4789.4—2016[7]適合于維生素C壓片糖果中菌落總數、霉菌和酵母菌、大腸菌群（第二法）、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的檢驗。