高效液相色譜法測定保健食品中維生素B2的含量

李 煜，黃美山，程琳琳

（無限極（營口）有限公司，遼寧營口 115000）

維生素B2又稱核黃素，作為營養補充劑或者是功能調節因子被廣泛用于保健食品和藥品當中[1]。因此，客觀、科學、準確、高效地測定維生素B2含量對政府監督管理和企業質量控制都有非常重要的意義。

目前，國標采用的高效液相色譜-熒光檢測法[2]，前處理煩瑣、檢測周期長、成本高，不適用于基質相對簡單的保健食品。中國藥典采用的高效液相色譜-紫外檢測法[3]，前處理簡單，但適用于成分單一的維生素B2片，對于添加多種維生素和礦物質的保健食品，其分析效果并不理想。另外，近年來也有高效液相色譜-紫外檢測法測定維生素B2含量的相關文獻[4-14]，由于維生素B2在反相色譜柱上的保留能力較差，文獻中大多在流動相中加入離子對試劑以改善峰形和分離度，但使用離子對試劑后平衡時間長且對色譜柱傷害大。

本文建立了一種簡便、快速、準確、靈敏的高效液相色譜-紫外檢測法，流動相不加入離子對試劑，適用于保健食品中維生素B2的定量檢測，顯著提高效率、降低成本。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

e2695高效液相色譜儀，配紫外檢測器（美國Waters公司）；SQP分析天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）；FE28 pH計（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；KQ-500VDB型超聲波振蕩器（昆山市超聲儀器有限公司）。

乙腈（色譜純，德國Merck公司）；三水磷酸氫二鉀（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；冰乙酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；維生素B2標準品（CAS號83-88-5，純度：96.8%，美國CATO公司，批號：CCFD200001-1901）。

本試驗中的多種維生素礦物質片由無限極（營口）有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）；流速：0.8 mL/min；柱溫：25 ；檢測波長：268 nm；進樣體積：5 μL；流動相A：乙腈；流動相B：25 mmol/L磷酸氫二鉀溶液（用磷酸調至pH 5.0～7.0），梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.2.2 標準溶液的配制

（1）標準儲備液。準確稱取10 mg維生素B2，置于100 mL棕色容量瓶中，加入0.012 mol/L鹽酸溶液，50 水浴超聲溶解后定容，混勻。在4 下可保存2個月。該標準儲備液的濃度為100 μg/mL。

（2）標準系列工作液。分別吸取維生素B2標準儲 備 液 1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、5.00 mL和8.00 mL，用水定容至10 mL，臨用前現配。該標準系列濃度分別為10.0 μg/mL、20.0 μg/mL、30.0 μg/mL、50.0 μg/mL 和 80.0 μg/mL。

1.2.3 樣品前處理

稱取均質后的試樣0.5 g（精確至0.001 g）于25 mL容量瓶中，加入1%冰乙酸-5%乙腈水溶液適量，65 水浴超聲使試樣充分勻散（約2 min），繼續加入1%冰乙酸-5%乙腈水溶液至接近刻度線，65水浴超聲（功率500 W、頻率45 kHz）至提取完全（約30 min），冷卻至室溫，加1%冰乙酸-5%乙腈水溶液定容至刻度，經0.45 μm濾膜過濾，即得。

1.2.4 方法學考察

（1）線性關系試驗。將標準系列工作液注入高效液相色譜儀，測定維生素B2的峰面積。

（2）回收率試驗。取已知含量的同一批樣品9份，取樣量減半，按1.5∶1、1∶1、0.5∶1左右加入標準品，每個添加水平各3份樣品，前處理后上機測定。

（3）重復性試驗。相同操作者、相同測量系統、相同操作條件、相同地點，并在短時間內對3種不同濃度（各6份），共18份樣品進行測定。

（4）中間精密度試驗。不同日期、不同分析人員、不同儀器，對同一批樣品各進行6次平行測定。

（5）檢出限和定量限試驗。先上機測定試劑空白，測出噪音值，再上機測定已知濃度的標準溶液，根據響應值將標準溶液逐級稀釋。以3倍信噪比時的濃度作為檢出限；以10倍信噪比時的濃度作為定量限，取6份空白樣品，加入定量限濃度的標準溶液，前處理后上機測定。

（6）穩定性試驗。取同一批樣品前處理后，分別放置0 h、6 h、12 h、24 h、36 h和48 h后上機測定。

（7）樣品測定。選擇不同濃度的6份樣品，前處理后上機測定。同時使用GB 5009.85—2016第一法進行維生素B2的測定。

2 結果與分析

2.1 提取溶液的選擇

取同一批樣品，分別用25 mmol/L磷酸氫二鉀溶液（pH 7.0）、0.01 mol/L氫氧化鈉溶液、0.02 mol/L氫氧化鈉溶液、1%冰乙酸-5%乙腈水溶液對樣品進行提取，4份樣品溶液同時上機測定。結果表明，1%冰乙酸-5%乙腈水溶液提取后的樣品溶液含量最高，因此選擇其作為提取溶液。

2.2 水浴溫度的選擇

取同一批樣品，分別用25 、45 、65 水浴超聲提取，3份樣品溶液同時上機測定。結果表明，65 水浴超聲提取的樣品溶液含量最高且接近理論值，因此選擇其作為水浴溫度。

2.3 檢測波長的選擇

取同一批樣品前處理后，分別選擇200 nm、220 nm、268 nm、280 nm和444 nm進行測定。結果表明，268 nm下目標峰面積最大，因此選擇其為檢測波長。

2.4 線性關系試驗

以標準系列工作液的峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程：Y=28 500X+46 900，R=0.999 572。結果表明，維生素B2在10～80 μg/mL范圍內呈良好的線性關系。

2.5 回收率試驗

由表2可知，樣品的回收率為90.1%～100.4%，表明該方法準確度良好。

表2 樣品的回收率結果表

2.6 重復性試驗

由表3可知，3種不同濃度樣品的RSD分別為0.74%、1.13%、1.85%（n=6）。表明該方法重復性良好。

表3 重復性（n=6）

2.7 中間精密度試驗

由表4可知，2位人員對同一批樣品檢測的RSD為2.58%（n=12）。表明該方法中間精密度良好。

表4 中間精密度（n=12）

2.8 檢出限和定量限試驗

標準溶液稀釋到3倍信噪比時的濃度為0.52 μg/mL，因此檢出限為0.52 μg/mL；標準溶液稀釋到10倍信噪比時的濃度為3.0 μg/mL，因此定量限為3.0 μg/mL。當定容體積為20 mL時，定量限為0.06 mg。取6份空白樣品，加入0.06 mg維生素B2，對加標樣品進行測定，其回收率為86.7%～90.0%，RSD為1.59%（n=6），表明該定量限的準確度和精密度良好。樣品回收率和重復性結果見表5。

表5 定量限濃度下的樣品回收率和重復性結果（n=6）

2.9 穩定性試驗

樣品溶液放置0～48 h測定結果的RSD為0.75%（n=6）。表明樣品溶液在48 h內穩定。結果見表6。

表6 不同放置時長的樣品溶液結果（n=6）

2.10 樣品測定

由表7可知，取不同濃度的6份樣品，使用本文建立的HPLC-UV方法和國標法分別測定維生素B2，維生素B2含量的相對平均偏差均在允許范圍內 （≤10%）。表明本文建立方法穩定可靠。

表7 不同方法測定的維生素B2含量結果

3 結論與討論

本文建立的高效液相色譜法，其線性、準確度、精密度、穩定性等均符合中國藥典四部9101[15]的要求，該方法操作簡便、穩定可靠，可以作為保健食品中維生素B2的測定方法。試樣前處理時，水浴溫度對結果影響較大，建議使用帶加熱控溫功能的超聲波振蕩器；對于成分復雜、不易提取的試樣，可將超聲時長由30 min延長至60 min；定容后可靜置1～2 h再吸取上清液過0.45 μm濾膜，過濾性更好。