紫甘薯中硒形態分析

劉淑梅，付 碩，黃雙建，周明言，趙重慶

（安徽創佳安全環境科技有限公司，安徽宿州 234000）

紫甘薯營養豐富，含膳食纖維、花青素、礦物元素等，是一種具有保健功效的農產品[1-2]。研究發現，甘薯中硒含量與其品種、產地的土壤特征等相關，土壤中硒酸鹽比亞硒酸鹽更容易被甘薯吸收利用[3-6]。硒是人體必需微量元素，但長期過量攝入硒會引起慢性毒性，其中無機硒比有機硒毒性大[7-8]。甘薯中硒的形態多樣，其營養價值與硒的形態分布有關。

硒在甘薯中以無機硒（硒酸鹽和亞硒酸鹽）和有機硒（硒代氨基酸）的形式存在，目前，對硒代氨基酸多采用GH/T 1135—2017液相色譜-原子熒光法（Liquid Chromatography-atomic Fluorescence Spectrometry，LC-AFS）[9]，該方法靈敏度有待提高，而電感耦合等離子體質譜可以明顯提高檢測的靈敏度，目前液相色譜-電感耦合等離子體質譜已廣泛應用于元素形態分析[10-12]。此外，對甘薯中無機硒和有機硒的提取尚缺一個通用的方法。本文建立了恒溫振搖輔助酶提取-高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法（High Performance Liquid Chromatography-Inductively CoupledPlasma Mass Spectrometry，HPLC-ICP-MS）測定紫甘薯中硒形態的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1260 HPLC-7700 ICP-MS（Agilent）；Milli-Q超純水系統（Millipore）；PB-10酸度計（Sartorius）；ZHWY-200B恒溫培養振蕩器（北京智誠搖床）；TE612-L電子天平（Sartorius）；BS210S電子天平（Sartorius）；Avanti JXN-30 高速離心機（Beckman）；KQ-500DA型數控超聲波清洗器（昆山超聲儀器）。

檸檬酸、己烷磺酸鈉、氨水、鹽酸和硝酸均為優級純；甲醇為色譜純。硒酸根、亞硒酸根、硒代胱氨酸、甲基-硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸標準溶液購于中國計量科學研究院；生物成分標準物質大蔥（GBW10049（GSB-27））；蛋白酶ⅩⅣ（3.5 μ/mg solid powder）購于 Sigma-Aldrich。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備與處理

紫甘薯清洗后攪拌粉碎，冷藏保存。①總硒的測定。稱取上述樣品0.5 g（精確到0.001 g）左右于三角燒瓶中，加入10 mL濃硝酸于電熱板200 熱消解，加置漏斗回流，消解徹底后趕酸定容，采用ICP-MS法測定總硒。②硒形態提取。稱取甘薯0.5 g左右（精確到0.001 g）于15 mL離心管中，加入5 mL純水后再加20 mg蛋白酶ⅩⅣ，渦旋混勻后放入恒溫培養振蕩器（37 ，100次/min）提取4 h。提取后于9 000 r/min（4 ）離心 10 min，取上清過 0.22 μm 濾膜后盡快測定。

1.2.2 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-Aq色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：A相為10 mmol/L檸檬酸+5 mmol/L己烷磺酸鈉+2%甲醇，B相為10 mmol/L檸檬酸銨（pH=7）+5 mmol/L己烷磺酸鈉+2%甲醇，梯度洗脫見表1；流速：1.2 mL/min；柱溫：30 ；進樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫表

1.2.3 ICP-MS參數

射頻功率：1 550 W；玻璃同心霧化器；蠕動泵速：0.1 r/（s總Se分析）/0.3 r/（s形態分析）；輔助氣流量：0.25 L/min；載氣流量：0.90 L/min；碰撞He氣流量5.5 mL/min；霧化室溫度：2 ；采樣深度：8 mm；積分時間：0.5 s；采集時間：8 min；采集質量數：78Se。

1.2.4 溶液配制

（1）硒 單 標 儲 備 液（10.0 mg/L）。 準 確 稱 取SeO42-、SeO32-、SeCys2、MeSeCys和 SeMet 5種 標準溶液，用純水分別稀釋定容，4 冷藏保存。

（2）硒形態混標液（1.0 mg/L）。分別準確吸取1 000 μL上述硒單標儲備液于10 mL容量瓶中，用純水稀釋定容，臨用現配。

（3）硒形態標準曲線。分別準確吸取一定量的1.0 mg/L硒形態混標液，用純水稀釋成0 μg/L、0.5 μg/L、1.0 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L、50.0 μg/L和100.0 μg/L硒形態混標準溶液，臨用現配。

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

Se的測定易受到多原子離子和雙電荷元素（稀土元素）的干擾，采用He模式可以有效降低40Ar38Ar+、41K37Cl+、40Ca38Ar+等 多 原 子 離 子 對78Se的干擾，利用調諧時降低雙電荷比率。本文比較了He模式（He，調諧最佳流量5.5 mL/min）及高氦模式（HEHe，調諧最佳流量10 mL/min）時5種硒形態的檢出限，最終選擇采用He模式（He，5.5 mL/min）測定78Se。

2.2 色譜條件優化

由于分析的5種Se形態含有2種離子態和3種有機態，本文選擇了一種反向離子對色譜柱（ZORBAX SB-Aq）作為分析柱，采用該色譜柱實現了5種硒形態的快速分離，在總分析時間上優于單純的陰離子色譜柱[13-14]。本文重點比較了不同濃度和pH的檸檬酸銨對5種形態的分離效果。

通過比較，各形態的分離基本不受檸檬酸/檸檬酸銨濃度變化的影響，而pH對硒的保留時間影響較大，隨著pH的升高，保留時間縮短，但靈敏度和分離度有所降低，尤其是2種無機硒分離變差。采用等度洗脫無法兼顧最佳分離度和分析時間，本文采用梯度洗脫方法，低pH有利于2種無機硒的分離，而高pH有利于縮短有機硒的保留時間。此外，添加少量離子對試劑可以改善形態分離，比較添加不同濃度（0 mmol/L、1 mmol/L、5 mmol/L和10 mmol/L）己烷磺酸鈉的效果，5 mmol/L即可獲較好得分離效果[15]。

流動相中加入適量的甲醇可以改善峰形和靈敏度、縮短有機形態保留時間。比較發現，低濃度的甲醇具有增敏作用，既提高了靈敏度，改善了峰型，也縮短了分析時間。但隨著甲醇濃度的增加，保留時間縮短的同時，靈敏度逐漸降低，本文選擇2%的甲醇比例。

2.3 樣品提取條件優化

紫薯中富含淀粉、蛋白等成分，而有機態硒代氨基酸多結合在蛋白多肽上，單純的稀酸提取效果不佳，本文采用復合酶蛋白酶ⅩⅣ對樣品進行提取，考慮到普通超聲提取長時間恒溫不易控制，而酶的最佳活性溫度為37 ，選擇用恒溫搖床輔助提取。重點考察了隨著酶的加入量和提取時間的增加，各形態的提取效果。

在適宜的溫度和pH下，增加酶的加入量可以加快催化效果。樣品量相同時，比較分別加入5 mg、10 mg、20 mg和30 mg蛋白酶ⅩⅣ提取1 h、2 h、4 h、6 h和8 h的提取效果。如表2所示，當酶加入量為20 mg，連續提取8 h即可獲得最佳的Se提取率。

表2 提取效果比較（單位：%）

2.4 加標回收

以最優條件進行分析，5種形態于6 min內得到分離，見圖1。以3倍基線噪聲（S/N=3）對應的濃度表示檢出限，以10倍基線噪聲（S/N=10）對應的濃度表示定量限。分別做低、中、高3個濃度（5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L）的樣品加標，每個濃度做7個平行樣，計算加標回收率和相對標準偏差，具體見表3。

圖1 加標樣品4 h酶提取色譜圖（加標濃度10 μg/L）

表3 5種形態的加標回收率

2.5 樣品測定

隨機采購市面上數種紫甘薯和富硒甘薯，采用本方法分析其5種硒形態，甘薯中的硒主要為SeMet，其中富硒甘薯中的SeMet含量明顯高于普通紫甘薯，而無機硒含量都較低，見圖2。

圖2 甘薯中的硒形態分析色譜圖

3 結論

本文建立了恒溫振搖輔助酶提取HPLC-ICP-MS法測定紫甘薯中硒形態的分析方法，方法簡單、靈敏、準確，適用于紫甘薯中5種硒形態分析，當酶加入量為20 mg，連續提取8 h即可獲得最佳的Se提取率，且結果表明富硒甘薯中的SeMet含量明顯高于普通紫甘薯，無機硒含量都較低。