TEMPO/STA在食品中金黃色葡萄球菌計數檢測的應用

楊梓瑩，曾 瑩，劉虹虹，覃 藍

（梧州市食品藥品檢驗所，廣西梧州 543002）

金黃色葡萄球菌是一種常見的食源性致病微生物，在人們日常生活中隨處可見，如空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中等。在一定的條件下，金黃色葡萄球菌會產生腸毒素，引起食物中毒。食品在空氣中暴露的時間越久，受到金黃色葡萄球菌的污染概率就越高。金黃色葡萄球菌污染食品的途徑一般有以下幾點：①食品加工相關人員或銷售人員攜帶有細菌，造成人為的食品污染；②食品在加工前已經帶菌，或在加工過程中受到了二次污染，產生了腸毒素；③熟食制品在運輸過程中包裝破損，受到外界的污染；④供食用的禽畜局部化膿時，對肉體其他部位的污染。因此，食品中金黃色葡萄球菌的計數檢測對防控由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒具有一定的重要性。

目前我國對食品中金黃色葡萄球菌計數檢測主要有2種方法：①《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》（GB 4789.10—2016）第二法 金黃色葡萄球菌平板計數法；②《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》（GB 4789.10—2016）第三法 金黃色葡萄球菌MPN計數法[1-2]。其中第二法Baird-Parker平板計數是最常用的。本研究中采用的TEMPO/STA，是一種可快速檢測食品中金黃色葡萄球菌的計數方法，使用TEMPO全自動微生物定量檢測儀，其原理是將待檢的樣品和培養基按比例混勻后，通過TEMPO填充器傳輸到3種不同規格的48孔卡片中。卡片內的培養基含有pH熒光指示劑，pH值達到中性時能夠產生被TEMPO讀數器檢測到的熒光信號[2-4]。在培養的過程中金黃色葡萄球菌會分解培養基，使培養基因為碳水化合物代謝而酸化，pH值數值的下降會讓熒光信號消失，得到陽性結果。按照MPN方法的原理，TEMPO系統根據陽性孔的數目和大小來推算出原始樣本中的金黃色葡萄球菌數，以CFU/g（mL）報告[5]。

本研究通過同時采用TEMPO/STA法和Baird-Parker平板計數法檢測食品中金黃色葡萄球菌，并對結果進行比較分析，旨在探求一種高效快速的檢驗檢測方法，在縮短檢驗檢測周期的同時降低人為因素影響，又適用于微生物實驗室的檢測要求，對食品中金黃色葡萄球菌的快速檢測提供一定的參考意見。

1 材料與方法

1.1 試劑與培養基

TEMPO金黃色葡萄球菌計數卡，biomerieux SA；TEMPO金黃色葡萄球菌培養基，biomerieux SA；Baird-Parker瓊脂、亞碲酸鉀卵黃增菌液、胰酪大豆胨液體培養基（TSB），廣東環凱微生物科技有 限 公 司；BioBallRe-Hydration Fluid，biomerieux SA；氯化鈉，廣東光華科技股份有限公司。

1.2 標準菌株

BioBall金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，NCTC 10788 10E8 x10），購于biomerieux SA；表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）CMCC（B）26069，購于中國食品藥品檢定研究院。

1.3 設備

全自動壓力滅菌器，山東新華醫療器械股份有限公司；智能生化培養箱，上海比朗儀器制造有限公司；拍擊式均質器，天津市恒奧科技發展有限公司；漩渦混合器，美國Thermo Fisher；重量稀釋儀，biomerieux SA；TEMPO充填器、TEMPO讀數器，biomerieux SA。

1.4 樣品類型

本研究選取了114個食品樣品，樣品種類包括熟肉制品、糕點、方便食品、調味品及其他類（包含飲料、果凍等樣品），以代表各類食品樣品。

1.5 試驗方法

1.5.1 樣品制備

標準菌株菌懸液制備。（a）陽性標準菌株菌懸液：將標準菌株BioBall金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureusNCTC 10788用BioBall Re-Hydration Fluid復蘇后，無菌操作制成10倍遞增稀釋的菌懸液。（b）陰性標準菌株菌懸液：將標準菌株表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）CMCC（B）26069 用TSB復活后，無菌操作制成10倍遞增的菌懸液。

將上述制備的陽性標準菌株菌懸液和陰性標準菌株菌懸液分別加入自然樣品制備的1∶10供試液中，分別作為陽性樣品菌懸液和陰性樣品菌懸液。

1.5.2 自然樣品制備

樣品制備按照GB 4789.10—2016[1]方法。無菌操作取25 g（mL）樣品于無菌過濾袋中，加入225 mL生理鹽水，拍擊均質，制成1∶10供試液，再依次稀釋成10倍遞增稀釋液，同時用于Baird-Parker平板計數法和TEMPO/STA法的測定。

1.5.3 樣品檢測

（1）Baird-Parker平板計數法[1]。選擇適合樣品稀釋度的陽性菌懸液、陰性樣品菌懸液和自然樣品供試液，吸取1 mL，以0.3 mL、0.3 mL和0.4 mL接種量分別加入3塊Baird-Parker平板中，然后用無菌L棒涂布均勻，置于培養箱內，（36 ±1） 培養（48±2） h。

（2）TEMPO/STA法。向TEMPO金黃色葡萄球菌卡片培養基里加入3.0 mL或3.9 mL滅菌水溶解干粉培養基，精確加入1.0 mL或0.1 mL 比例1∶10標準菌株菌懸液和自然樣品供試液，充分混勻，將樣品制成1∶40（計數范圍為10～4.9×104CFU/g）或 1∶ 400（計數范圍為 10～ 4.9×105CFU/g）的TEMPO/STA測試卡。將制備好的TEMPO/STA培養卡放進培養箱內，（36±1） 培養24 h。

2 結果與分析

2.1 標準菌株的添加試驗

2.1.1 陽性樣品的添加試驗

將1.5.1制備的陽性樣品菌懸液同時采用TEMPO/STA法和Baird-Parker平板計數法進行檢測，將檢測結果作差異性比較，結果見表1。由表1可知，2種方法對添加標準菌株的陽性樣品的檢測結果經t檢驗無明顯差異。

表1 2種方法對陽性樣品添加試驗的檢測結果

2.1.2 陰性樣品的添加試驗

將1.5.1制備的陰樣品菌懸液同時采用TEMPO/STA法和Baird-Parker平板計數法進行檢測，將檢測結果進行差異性比較，結果見表2。由表2可知，2種方法對添加標準菌株的陰性樣品的檢測結果一致，說明TEMPO/STA法的高準確度以及高特異性，降低了檢驗過程中食品中金黃色葡萄球菌出現假陽性或者假陰性的風險。

表2 2種方法對陰性樣品添加試驗的檢測結果

2.2 自然樣品的檢測試驗

將1.5.2制備的自然樣品供試液用TEMPO/STA法和Baird-Parker平板計數法同時進行檢測比較，將檢測結果進行符合率比較，結果見表3。

表3 2種方法檢測自然樣品的符合率

由表3可知，TEMPO/STA法和Baird-Parker平板計數法對自然樣品的檢測在檢測結果上總符合率達到96.5%，說明這2種方法之間無顯著性差異。114個自然樣品中僅有4個樣品的檢測結果不一致，這可能是由于：①pH值的影響；②樣品顏色過深影響讀數器結果判定；③樣品油脂過多。

3 討論

目前GB 4789.10—2016是我國對食品中金黃色葡萄球菌定量檢測的主要方法，實驗的基本操作流程為樣品的無菌取樣、均質和稀釋，涂布平板，培養，確證計數。微生物基本操作方法需要花費大量的實驗人員和實驗耗材，實驗過程中的人為操作誤差也會比較大，而且在挑選可疑菌落并確證過程中，依賴的是實驗人員專業知識的判斷，易產生主觀上的錯判或者漏判，因此會增加或者降低試驗結果確證的不確定性，導致最終結果報告存在誤差。

TEMPO/STA法是一種全新的基于MPN原理的全自動微生物定量檢測法，與傳統的MPN計數檢驗方法相比有著顯著優勢，單個稀釋級的重復管數為16個，總管數48個，結果精密度遠遠高于傳統的9管法MPN值測定法。相比傳統的金黃色葡萄球菌定量檢測方法，TEMPO/STA法具有全面自動化的特點，加樣填充、讀數均由儀器完成，簡化了手工操作步驟的同時也降低了不同實驗人員因為操作熟練程度和實驗經驗不同而導致的實驗誤差，提高了檢測結果的準確度。TEMPO/STA法還具有縮短檢測周期、減少人為因素影響的優點，并且每張TEMPO/STA測試卡面都有唯一的條形碼，可確保檢測結果的獨立性和可溯源性。

本研究采用TEMPO/STA法和Baird-Parker平板計數法檢測114個不同類型的自然樣品中的金黃色葡萄球菌，雖然2種方法的檢測原理不同，但檢測結果顯示符合率高達96.5%，說明這2種檢測方法之間不存在顯著性差異。

4 結論

TEMPO/STA法作為一種全新的全自動微生物定量檢測法，其檢測結果與Baird-Parker平板計數法檢測結果符合率達96.5%，且實驗過程操作簡便、檢測結果準確度高，能保證檢測結果的唯一性和溯源性，可廣泛應用于食品中金黃色葡萄球菌的檢測。