盤龍七片緩解關節炎軟骨細胞損傷和炎癥反應

宋啟春,趙 研,李 東,宋繼東,樊立宏,時志斌

(西安交通大學第二附屬醫院骨一科,西安 710004;*通訊作者,E-mail:zhibin-shi@126.com)

骨關節炎(osteoarthritis,OA)是一種常見慢性關節退行性疾病,多發生于老年人,表現為關節軟骨破壞、關節邊緣骨質增生及軟骨下骨硬化[1-3]。流行病學研究顯示,骨關節炎是導致下肢殘疾的十大常見病因之一,發病率逐年提高,嚴重影響患者的生活質量[4]。軟骨細胞炎癥和細胞基質丟失一直被認為是加重骨關節炎進程的重要病因之一[5]。

盤龍七片是由著名老中醫王家成所獻祖傳秘方,經科學研制而成的中成藥,臨床應用表明其對骨關節炎病癥具有顯著療效[6,7]。然而關于盤龍七片對骨關節炎軟骨細胞損傷的保護作用及其相關機制的研究仍然極為有限。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)作為一類異質性非編碼RNA,其基因組的數量在發育和分化過程中顯著增加,證明lncRNA在基因表達調控中起著至關重要的作用[8]。有研究表明,lncRNA前列腺癌相關轉錄本1(prostate cancer-asso-ciated transcript 1,PCAT-1)在關節炎軟骨細胞中被顯著上調;在分離培養的人關節炎軟骨細胞中下調PCAT-1可顯著抑制細胞凋亡[9]。目前為止,沒有報道表明盤龍七片是否可通過PCAT-1緩解關節炎軟骨細胞的損傷及炎癥反應。本研究通過分離培養骨關節炎軟骨細胞,探究盤龍七片對其保護作用及作用機制,為解析盤龍七片治療骨關節炎的藥理機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

ACAN兔單抗、COL2A1兔單抗、MMP-13單抗、Caspase-3兔單抗、GAPDH兔多抗和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗購自英國Abcam公司;BCA試劑盒購自美國Pierce公司;TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒購自美國Cell Singnal Technology公司;SuperScriptTMPreamplification System for First Strand cDNA Synthesis試劑盒購自美國Gibco公司;pDNA3.1-PCAT-1購自上海吉瑪制藥技術有限公司。

1.2 骨性關節炎模型的建立

8周齡雄性SD大鼠45只,體質量280-320 g,采購自斯貝福(北京)生物技術有限公司,2%水合氯醛0.2 ml/10 g腹腔內注射麻醉小鼠,夾尾無反應后,曲屈大鼠膝關節,于關節兩側進針。在1,4,7 d,分別將0.2 ml 4%木瓜蛋白酶水溶液注射到膝關節腔內(刺破關節腔時有突破感,注射藥物時無阻力)。隨后進行膝關節Lequesne MG評估級別,平均評分>40說明大鼠膝關節骨性關節炎模型建立成功。

1.3 骨關節炎軟骨細胞分離、培養及分組

脫頸法處死關節炎模型大鼠,75%乙醇內浸泡消毒15 min,PBS清洗,分離大鼠四肢并放入D-Hanks液內,分離并剝離大鼠關節軟骨組織,剪切組織小塊(1 mm3),轉移至離心管內(15 ml),用0.25%胰蛋白酶-EDTA在37 ℃消化30 min,37 ℃條件下用2 mg/ml Ⅱ型膠原酶消化4 h,以1 000 r/min離心收集底層軟骨細胞,加入含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM/F12培養基重懸細胞,37 ℃、5%CO2培養,每2 d更換1次培養基,使用0.25%胰蛋白酶消化傳代。實驗分組如下:對照組(正常培養的骨關節炎軟骨細胞),30,60,90,120 μg/ml組(30,60,90,120 μg/ml盤龍七片處理24 h的骨關節炎軟骨細胞),盤龍七片+PCAT-1組(轉染pcDNA3.1-PCAT-1后60 μg/ml盤龍七片處理24 h的骨關節炎軟骨細胞),盤龍七片+pcDNA3.1組(轉染pcDNA3.1后60 μg/ml盤龍七片處理24 h的骨關節炎軟骨細胞)。

1.4 骨關節炎軟骨細胞凋亡檢測

采用TUNEL法測定對照組、30 μg/ml組、60 μg/ml組、90 μg/ml組、120 μg/ml組的細胞凋亡。吸棄細胞的培養基,PBS洗滌3次,加入1 ml 4%的多聚甲醛,固定細胞20 min,用PBS清洗3次,按照說明書配制TUNEL檢測液,每個樣品中加入50 μl TUNEL檢測液,37 ℃孵育60 min,而后用PBS清洗2次,每次3 min。用熒光淬滅封片液封片,熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.5 骨關節炎軟骨細胞DNA含量檢測

對照組、30 μg/ml組、60 μg/ml組、90 μg/ml組、120 μg/ml組爬片處理后,PBS洗滌2次,加500 μl蛋白酶K溶液,置于56 ℃環境下6 h,加入1 μl Hoechst 33258,室溫下避光反應30 min,在熒光酶標儀上,檢測460 nm處上清液的吸光度值。以小牛胸腺DNA為標準曲線,計算出各組樣本中DNA含量。

1.6 骨關節炎軟骨細胞增殖檢測

CCK-8法測定對照組、30 μg/ml組、60 μg/ml組、90 μg/ml組、120 μg/ml組、盤龍七片+PCAT-1組和盤龍七片+pcDNA3.1組細胞增殖。取培養后第3-5代軟骨細胞,以1×104/孔的密度接種于96孔板,37 ℃、5%CO2培養24 h,待其細胞貼壁后分別加入不同濃度盤龍七片或細胞轉染,繼續培養24 h,PBS清洗,每孔加入10 μl CCK-8試劑繼續孵育2 h。酶標儀測定各孔490 nm波長處吸光度值,每組3個復孔取平均值。

1.7 骨關節炎軟骨細胞炎癥因子檢測

ELISA試劑盒檢測對照組、30 μg/ml組、60 μg/ml組、90 μg/ml組、120 μg/ml組、盤龍七片+PCAT-1組和盤龍七片+pcDNA3.1組IL-1β和TNF-α水平。收集各組細胞,以12 000 r/min 4 ℃離心20 min,取上清液,按照ELISA試劑盒說明書進行檢測,首先樣品加入反應孔后37 ℃孵育45 min,洗滌液洗滌后加入生物素標記的抗體37 ℃反應30 min。然后加鏈霉親和素-HRP混勻37 ℃反應30 min,再加入顯色劑避光顯色15 min。最后加終止液終止反應,用酶標儀檢測450 nm處吸光度值,計算各因子含量。

1.8 RT-qPCR檢測骨關節炎軟骨細胞中PCAT-1含量檢測

按照Trizol說明書提取對照組和60 μg/ml組細胞總RNA,采用SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis試劑盒合成cDNA。按照TaKaRa熒光定量試劑盒使用說明配制反應體系,以GAPDH為內參進行PCR擴增,每個樣品重復3次,循環條件為95 ℃ 30 s,60 ℃30 s;72 ℃30 s,共40個循環;60 ℃延長5 min。PCAT-1上游引物:5′-AAT GGC ATG AAC CTG GGA GGC G-3′,下游引物:5′-GGC TTT GGG AAG TGC TTT GGA G-3′;GAPDH上游引物:5′-ACT GGC GTC TTC ACC3′,下游引物:5′-CGA ACA TGG GGG CAT-3′。2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

1.9 骨關節炎軟骨細胞中蛋白含量檢測

采用Western blot方法檢測對照組、30 μg/ml組、60 μg/ml組、90 μg/ml組、120 μg/ml組、盤龍七片+PCAT-1組和盤龍七片+pcDNA3.1組中蛋白含量。收集各組細胞,加入RIPA裂解液,在冰上裂解15 min,以12 000 r/min 4 ℃離心30 min,棄去上清液。蛋白質樣品經10% SDS-PAGE分離并轉移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h,PBS洗去封閉液,加一抗:ACAN、COL2A1、MMP-13、Caspase-3或GAPDH兔多克隆抗體(均為1 ∶800),4 ℃孵育過夜。PBS清洗膜,加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗,室溫孵育1 h,加入ECL發光液避光顯影于凝膠成像儀曝光拍照。GAPDH為內參對照蛋白。

1.10 pDNA3.1-PCAT-1轉染骨關節炎軟骨細胞

將骨關節炎軟骨細胞接種于96孔板,37 ℃,5%CO2條件下培養12 h,待細胞融合達到80%,按照轉染試劑Turbofect操作說明進行細胞轉染實驗。將0.3 μg pDNA3.1-PCAT-1或pDNA3.1分別與0.6 μl Turbofect混勻,而后轉染進入于96孔板中培養的細胞,37 ℃,5% CO2孵育24 h用60 μg/ml盤龍七片處理24 h。采用RT-qPCR方法檢測轉染效率。

1.11 統計學分析

2 結果

2.1 盤龍七片促進骨關節炎軟骨細胞增殖

結果表明,與對照組比較,30 μg/ml盤龍七片對骨關節炎軟骨細胞增殖無明顯的作用,60,90,120 μg/ml盤龍七片均可顯著促進骨關節炎軟骨細胞增殖(P<0.05,見圖1)。另外DNA含量檢測同樣顯示30 μg/ml組中DNA含量較對照組無明顯變化。60,90,120 μg/ml組DNA含量較對照組均有顯著上升(P<0.05,見圖1)。

2.2 盤龍七片抑制骨關節炎軟骨細胞凋亡

TUNEL實驗顯示,與對照組比較,30 μg/ml盤龍七片對骨關節炎軟骨細胞凋亡沒有明顯的作用。60,90,120 μg/ml盤龍七片均可顯著抑制骨關節炎軟骨細胞凋亡(P<0.05,見圖2)。Caspase-3活性檢測中,與對照組比較,30 μg/ml盤龍七片對骨關節炎軟骨細胞Caspase-3活性沒有明顯的作用。60,90,120 μg/ml組較對照組可顯著抑制骨關節炎軟骨細胞Caspase-3活性(P<0.05,見圖2)。

2.3 盤龍七片對骨關節炎軟骨細胞細胞外基質合成及降解的作用

與對照組比較,30 μg/ml盤龍七片對骨關節炎軟骨細胞ACAN、COL2A1和MMP-13蛋白表達量均沒有明顯的作用。60,90,120 μg/ml組較對照組顯著抑制骨關節炎軟骨細胞MMP-13蛋白表達量和促進ACAN和COL2A1蛋白表達量(P<0.05,見圖3)。

與對照組比較,*P<0.05圖1 盤龍七片對骨關節炎軟骨細胞增殖和DNA含量的影響Figure 1 Effect of Panlongqi tablets on proliferation and DNA content of osteoarthritis chondrocytes

與對照組比較,*P<0.05圖2 盤龍七片對骨關節炎軟骨細胞凋亡的影響Figure 2 Effect of Panlongqi tablets on the apoptosis of osteoarthritis chondrocytes

2.4 盤龍七片抑制骨關節炎軟骨細胞炎癥相關因子

與對照組比較,30 μg/ml盤龍七片對骨關節炎軟骨細胞中IL-1β和TNF-α表達量均沒有明顯的作用,60,90,120 μg/ml組骨關節炎軟骨細胞IL-1β和TNF-α表達量則顯著降低(P<0.05,見圖4)。綜上,本研究選用60 μg/ml盤龍七片進行后續試驗。

與對照組比較,*P<0.05圖3 盤龍七片對骨關節炎軟骨細胞ACAN、COL2A1和MMP-13蛋白表達量的影響Figure 3 Effect of Panlongqi tablets on ACAN, COL2A1 and MMP-13 protein expression in osteoarthritis chondrocytes

與對照組比較,*P<0.05圖4 盤龍七片對骨關節炎軟骨細胞炎癥因子含量的影響Figure 4 Effect of Panlongqi tablets on the content of inflammatory factors in osteoarthritis chondrocytes

2.5 盤龍七片抑制骨關節炎軟骨細胞中PCAT-1

結果顯示,與對照組比較,60 μg/ml盤龍七片可顯著抑制骨關節炎軟骨細胞中PCAT-1表達量(P<0.05,見圖5)。

2.6 盤龍七片可通過PCAT-1抑制骨關節炎軟骨細胞損傷

盤龍七片+PCAT-1組中PCAT-1表達量較盤龍七片+pcDNA3.1組顯著升高(P<0.05,見圖6),過表達實驗成功。與盤龍七片+pcDNA3.1組比較,盤龍七片+PCAT-1組中細胞增殖和ACAN蛋白表達量均顯著降低(P<0.05),Caspase-3活性、MMP-13、IL-1β和TNF-α水平均顯著升高(P<0.05,見圖6)。

與對照組作比較,*P<0.05圖5 盤龍七片對骨關節炎軟骨細胞中PCAT-1表達量的影響Figure 5 Effect of Panlongqi tablets on the expression of PCAT-1 in osteoarthritis chondrocytes

與60 μg/ml組作比較,*P<0.05圖6 盤龍七片可通過PCAT-1抑制骨關節炎軟骨細胞損傷Figure 6 Panlongqi tablets inhibits osteoarthritis chondrocyte damage through PCAT-1

3 討論

關節炎是以關節軟骨退變為核心,累及骨質,并包括滑膜、關節囊及關節囊外其他結構的不同程度的炎性病變[10,11],其重要特征是軟骨細胞死亡及軟骨基質代謝失衡,軟骨細胞炎癥因子的表達和異常凋亡對關節炎的發生發展至關重要[12,13]。近年來,醫藥工作者利用中醫藥手段治療骨性關節炎等相關疾病,取得了大量研究成果[14]。盤龍七片以盤龍七、竹根七、羊角七、青蛙七、川烏、草烏、當歸、杜仲、紅花、過山龍、丹參等為主要成分,具有活血、通絡、抗炎和祛風濕等藥理作用[15]。臨床應用表明,盤龍七片對包括骨關節炎在內的不同類型的骨科疾病均具有明顯的臨床療效,既往關于盤龍七片治療骨關節炎的研究主要針對其臨床療效,對其調控骨關節炎軟骨細胞的具體機制的研究極為有限[16-18]。因而,探究盤龍七片對骨關節炎軟骨細胞增殖、凋亡、炎癥和骨基質代謝的作用及機制具有重要意義。ACAN和COL2A1是構成軟骨基質的主要成分[19]。IL-1β和TNF-α是重要的炎癥因子,可刺激基質金屬蛋白酶(MMPs)的合成,而MMPs具有促進軟骨基質降解的作用[20,21]。本研究通過建立大鼠膝關節骨性關節炎模型并分離培養骨關節炎軟骨細胞,探究盤龍七片對骨關節炎軟骨細胞增殖、凋亡、炎癥和骨基質代謝的作用。結果表明,30 μg/ml盤龍七片對骨關節炎軟骨細胞增殖、凋亡、DNA含量、炎癥因子水平(IL-1β和TNF-α)、ACAN、COL2A1、MMP-13和Caspase-3蛋白表達量均無明顯作用,我們推測是因為盤龍七片濃度太低,無法發揮作用。與對照組相比,60,90,120 μg/ml組均顯著促進骨關節炎軟骨細胞增殖、DNA含量、ACAN和COL2A1蛋白表達,同時顯著降低骨關節炎軟骨細胞凋亡、炎癥因子水平(IL-1β和TNF-α)、MMP-13和Caspase-3蛋白表達量;同時,60,90,120 μg/ml三組之間無顯著差異。因此,本研究首次揭示盤龍七片(60,90,120 μg/ml)可顯著促進體外培養的骨關節炎軟骨細胞增殖,抑制其凋亡、炎癥反應和細胞基質降解。

近年來研究發現,lncRNA在關節炎軟骨細胞增殖、凋亡過程中和維持軟骨細胞內環境穩定方面發揮著重要作用[22-24]。研究人員發現敲除lncRNA MFI2-AS1可顯著抑制LPS誘導的軟骨細胞損傷和軟骨基質降解,從而減緩關節炎的疾病進展[25]。Li等[26]干擾LPS誘導的關節軟骨細胞中的lncRNA MALAT1后發現,細胞增殖和細胞外基質降低,同時細胞凋亡和炎癥因子水平顯著升高。最近,Zhou等[9]發現骨關節炎軟骨細胞的PCAT-1表達量上升,干擾PCAT-1可顯著抑制骨關節炎軟骨細胞凋亡,過表達PCAT-1顯著促進凋亡。然而還沒有文獻報道表明盤龍七片是否可以通過PCAT-1調控關節炎軟骨細胞損傷。本研究表明盤龍七片(60 μg/ml)顯著抑制骨關節炎軟骨細胞PCAT-1的表達量,且過表達PCAT-1可明顯抵消盤龍七片(60 μg/ml)對關節炎軟細胞增殖和ACAN蛋白表達量的促進作用,及對IL-1β和TNF-α水平、Caspase-3和MMP-13蛋白表達量的抑制作用。本研究中過表達PCAT-1對細胞凋亡的作用與Zhou等[9]報道的PCAT-1對關節炎軟骨細胞凋亡的作用一致。本研究提示,在骨關節炎軟骨細胞中,盤龍七片可能通過下調PCAT-1的表達量,進一步促進骨關節軟骨細胞增殖,抑制凋亡、炎癥反應和細胞基質降解。

綜上所述,盤龍七片可能通過調控PCAT-1對骨關節炎軟骨細胞增殖和軟骨基質形成具有促進作用,且抑制骨關節炎軟骨細胞凋亡和炎癥因子生成,進而抑制骨關節炎軟骨細胞損傷,為解析盤龍七片治療骨關節炎的藥理機制提供依據。