糖氧剝奪對大鼠脂肪干細胞自噬和成脂的影響*

袁志堅 吳小瑜 何文涓 丁亞明 鐘曉春

(1.無錫衛生高等職業技術學校，無錫 214028)(2.杭州師范大學醫學院，杭州 311121)

細胞自噬是近年來尚待進一步認識的且與細胞生長繁殖相關的重要知識。目前對自噬有兩種觀點：一種為自噬不利于細胞正常生長。左旋棉酚可能通過誘導細胞自噬下調B淋巴細胞刺激因子(B lymphocytestimulator stimulctor，BLyS)的表達，從而抑制細胞生長[1]；另一種為自噬有利于細胞生長。賈紹輝等[2]發現在正常情況下，運動可以誘導機體多種組織細胞自噬的激活，心肌細胞的自噬激活對于維持心肌自身功能有重要的作用。大量研究表明，自噬在細胞新陳代謝和生理功能上有雙重作用，在疾病發生的不同時期，自噬起到不同的作用，需要根據具體細胞生長條件確定[3-5]。因此，本研究以缺糖缺氧狀態下，大鼠ADSC為研究對象，在體外研究自噬參與ADSC移植的作用及機制，最終目標是探索移植過程中提高ADSC存活及成脂的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

血清購自杭州萬研科技有限公司；低糖DMEM培養基(含青霉素100 U/mL和鏈霉素100 μg/mL)及EBSS(Earle′s平衡鹽溶液)購自杭州吉諾生物醫藥技術有限公司；Ⅰ型膠原酶購自生工生物工程(上海)股份有限公司、Western blot及IP細胞裂解液、蛋白上樣緩沖液和預染蛋白marker購自上海碧云天生物技術有限公司；pmTOR和LC3兔單抗購于cell;Actin兔單抗購自杭州華安生物公司；羊抗兔Anti-Rabbit IgG(H+L)(DyLight 800)購自Cell Signaling；蛋白印跡凝膠電泳試劑盒購自武漢谷歌生物技術公司；Micro BCA Protein Assay Kit購自Pierce；PVDF膜購自Millipore；CoCl2、胰酶消化液、離心管、EP管及移液槍頭購自國藥集團化學試劑有限公司；電泳轉膜設備購自Bio-rad；OriCell SD大鼠ADSC成脂誘導分化培養基試劑盒購自Cyagen；SD大鼠購自上海斯萊克公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(浙)2016-0004，實驗動物使用許可證號：SYXK(浙)2016-0014。動物實驗經合作單位杭州師范大學實驗動物福利倫理審查批準，編號：2017-1002。

1.2 方法

1.2.1ADSC培養:參照何文涓等[6]報道，選擇SPF級，雄性SD大鼠，體質量為150～200 g，20只，6～8周齡。將大鼠頸椎脫臼處死，75%乙醇浸泡消毒，無菌條件下取出大鼠的脂肪組織浸于DMEM基礎培養基中，按常規進行洗滌，去除脂肪組織中肉眼可見的纖維及血管成分，加入0.1%的Ⅰ型膠原酶，在37 ℃下消化40 min，然后用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養基終止消化。100目濾網過濾，1 300 r/min離心10 min，棄去上層漂浮的脂肪細胞和培養液，沉積的細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養液轉移至培養瓶中，置于37 ℃、飽和濕度和5%CO2培養箱中培養，待細胞達80%左右融合率時即可進行傳代，更換培養液1/3～1/2，然后繼續培養觀察。根據細胞生長狀態及培養基顏色變化，2～3 d換液1/3～1/2，經數代培養及成脂誘導觀察為ADSC。

1.2.2MTT實驗:將上述ADSC胰酶消化，計數細胞，調整細胞濃度為5×104/mL，每孔100 μL接種于96孔細胞培養板，37 ℃培養箱放置1 d。分別設置對照組(G組，10%胎牛血清的低糖DMEM)、少糖組(SG組，10%胎牛血清的無糖DMEM∶低糖DMEM=1∶1)、缺氧組(G+CoCl2，含10%胎牛血清的低糖DMEM+100 μmol/L的CoCl2)和缺氧少糖組(SG+CoCl2組，含10%胎牛血清的無糖DMEM∶低糖DMEM=1∶1+100 μmol/L的CoCl2)。每組3孔，混勻后繼續培養，分別于第2、3和4天，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，混勻后置于37 ℃培養箱中，培養4 h后，1 000 r/min離心5 min，去上清，然后每孔加入150 μL DMSO，振蕩混勻溶解，酶標儀上490 nm檢測光密度OD值。

1.2.3Western blot分析:取培養第3代的大鼠ADSC，胰酶消化離心回收，按照2×106/瓶接種到培養瓶中，置于37 ℃培養箱過夜。第2天分別設置G組、SG組、G+CoCl2組、SG+CoCl2組和EBSS組(自噬陽性對照組，10%胎牛血清的低糖DMEM+5 mL的Earle′s平衡鹽溶液)，所有組分別取培養第3代ADSC，用PBS沖洗三次，各組分別進行相關的處理后，EBSS組細胞37 ℃培養箱培養3 h后，其余組放置細胞培養箱24 h后，回收細胞。按照Western blot及IP細胞裂解液說明提取蛋白，用試劑盒Micro BCA Protein Assay Kit測試樣本中蛋白質含量，PBS調整蛋白濃度一致，100 ℃水浴5 min后冷卻、分裝，-80 ℃保存備用。

12%的聚丙烯酰胺上樣，60 V電泳30 min，120 V電泳至溴酚藍接近底部，停止，轉膜PVDF，5%脫脂牛奶封閉1 h，樣本PVDF膜剪成三份，分別置于Actin兔單抗、pmTOR兔單抗和LC3兔單抗反應液中4℃搖床過夜。第2天，TBST漂洗三次后，置于羊抗兔Anti-Rabbit IgG(H+L)(DyLight 800)反應液避光反應2 h后，TBST避光漂洗三次，然后置于 Odyssey近紅外掃描儀上成像保存。

1.2.4成脂誘導后油紅“O”染色及比色實驗:取第三代ADSC，胰酶消化回收，細胞計數，以每孔接種2 mL，濃度為1.5×104個/mL的細胞于直徑為3 cm細胞培養皿中，放置37 ℃細胞培養箱中培養。

參照OriCell SD大鼠脂肪間質干細胞(adipose stem cell,ASC)成脂誘導分化培養基試劑盒使用說明，配制不同組別的誘導分化培養基，分別為 A液和B液4 ℃保存備用。

細胞100%融合后，去除皿內培養液，加成脂誘導劑A液系列2 mL，3 d后去上清，加成脂誘導劑B液系列作用24 h，如此A、B液系列交替三次；繼續B液系列維持2 d 換液一次，6 d后停止。棄上清，PBS沖洗兩次，加入2 mL 4%中性甲醛溶液30 min，棄上清，PBS沖洗兩次，加入1 mL 油紅“O”染料工作液30 min，棄上清，PBS沖洗兩次，顯微鏡下觀察攝像，加40%異丙醇1 mL，洗去油紅“O”染料背景色，棄上清加500 μL異丙醇作用30 min，吸取300 μL進入96孔板中，490 nm測量OD值。

1.2.5圖像數據處理：Odyssey近紅外掃描儀操作軟件拍照。測試數值用Excel自帶統計函數，t檢驗分析并作圖。

2 結果

2.1 大鼠ADSC的培養

分離大鼠ADSC，37 ℃培養48 h后，細胞部分貼壁生長，以梭行為主(圖1A)，同時懸浮的液體里可見漂浮的細胞和雜質。經3～4次換培養液后，貼壁細胞接觸生長至約80%，更符合纖維細胞形態(圖1B)，懸浮的細胞和雜質更少，并出現少量油脂樣顆粒。此后消化傳代，繼續培養，傳代三次后，當細胞再次接觸生長至約80%時，進行后續實驗。

圖1 大鼠ADSC培養不同時間(×100)

2.2 不同培養條件下ADSC增殖變化

培養三代后的大鼠ADSC，胰酶消化后接種至96孔細胞培養板。在不同培養條件下(缺糖缺氧)分別作用24 h、48 h和72 h。MTT分析結果，隨著時間延長，ADSC細胞均有增殖，48 h達到最大，72 h進入平臺期。培養24 h，G組與其它三組比較沒有統計學差異(P>0.05)，而48 h，G組細胞增殖明顯高于其它三組(P<0.05)，進入平臺期(72 h)，G組細胞增殖仍然高于其它三組(P<0.01)，如圖2所示。

圖2 MTT檢測細胞存活生長狀態

2.3 自噬相關基因pmTOR和LC3的表達

上述培養條件作用24 h后，回收細胞進行基因表達Western blot分析，EBSS組、G組和的SG組LC3-Ⅰ明顯弱于LC3-Ⅱ，表明G組和SG組的細胞自噬與EBSS組接近，而G+CoCl2組和SG+ CoCl2組的LC3-Ⅰ明顯高于EBSS組，表明CoCl2抑制了細胞自噬，5個實驗組的pmTOR未見明顯變化，則說明實驗中細胞自噬的變化與pmTOR無關(圖3)。

圖3 Western blot分析蛋白表達熒光二抗掃描

2.4 成脂誘導油紅“O”染色及比色

5個實驗組的ADSC經成脂誘導油紅“O”染色，G組細胞數目多且橘紅色脂粒豐富，而SG+CoCl2組細胞和脂粒均稀少(圖4)。異丙醇溶解脂滴中的油紅“O”染料，經490 nm比色，發現G組OD值最大。與G組比較，SG組、G+CoCl2組及SG+CoCl2組均有統計學差異(P<0.05)。其中SG+CoCl2組降低明顯(P<0.01)，而在G+CoCl2組中，CoCl2的加入，與G+CoCl2組油紅“O”比色，OD值更低，差異極顯著(P<0.01)，如圖5所示。

圖4 成脂誘導后油紅“O”染色顯微鏡觀察(×100)

圖5 油紅O染色490 nm的OD值

3 討論

本研究結果與周明輝等[7]報道相一致，而糖氧剝奪對大鼠ADSC增殖變化情況表明少糖、缺氧條件明顯影響ADSC的生長狀態，CoCl2誘導的化學缺氧對細胞的生長起抑制作用[8]。在自噬相關基因pmTOR和LC3的表達研究中發現，G組細胞自噬LC3與EBSS組接近，說明正常培養的細胞自噬旺盛，推測一定程度上細胞自噬是細胞的一種自我保護機制，這種自噬情況可參考賈紹輝等[2]報道，即：自噬為在饑餓狀態下，脂肪細胞存活中發揮保護性作用，提高自噬水平有助于降低饑餓狀態下脂肪細胞的凋亡水平[9]。SG組的LC3表現與G組和EBSS組接近，推測可能是LC3-Ⅰ已經降解完畢，再增加自噬也不起作用。在此情況下，缺糖也可以抑制細胞自噬，需要進一步研究。G+CoCl2組可見LC3-Ⅰ的含量增加，說明自噬受到抑制，這與韓苗苗等[10]報道相一致。SG+CoCl2組與G+CoCl2組，沒有明顯的區別，推測可能是少糖的量不足以對抗化學缺氧劑CoCl2的作用(圖3)。此外，pmTOR的量各組均無明顯的區別，則表明上述細胞自噬分子信號途徑不通過pmTOR，實際上可能如尹長偉等[11]報道，缺糖是通磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(pAMPK)，缺氧是通過低氧誘導因子1-α/自噬相關基因(HIF1-α/Beclin)的自噬效應途徑。Karabiyik等[12]研究報道，糖剝奪通過AMP依賴蛋白激酶(AMPK)依賴的方式，經下游蛋白激酶復合體(ULK1)分子介導FYVE手指的磷酸肌醇激酶(PIKfyve)活化誘導自噬。參照李德全等[13]和Yamaguchi等[14]實驗，經比色分析，G組OD值最高。與G組比較，另外三組OD值均明顯降低(P<0.01～0.05)，而且SG+CoCl2組降低最明顯(P<0.01)，說明缺糖缺氧是脂肪移植成敗的重要因素。細胞自噬的研究，一般地認為是細胞保護自救，但生物的復雜性使其不完全如此。處于危機狀態的細胞，自噬反而可能是導致細胞死亡的主要原因。在本研究中，推測自噬本身也是一種消耗能量的過程，在缺氧(G+CoCl2組)和缺氧缺糖(SG+CoCl2組)的條件下，能量極度缺乏，所供能量無法支持細胞自噬的進程，因此自噬也受到抑制。本研究認為大鼠ADSC具有較強的細胞自噬作用，在糖氧剝奪下抑制細胞自噬，降低ADSC的存活率以及ADSC誘導分化成脂率。