miR-143-3p通過調節TGIF2的表達在甲狀腺癌中的作用研究*

李 佳 李 濤 潘 婧 趙 茜 劉 莉

(1.保定市第二醫院檢驗科，保定 071000)(2.保定市南市區婦幼檢驗科，保定 071000)(3.保定市第五醫院檢驗科，保定 071000)

甲狀腺癌(thyroid cancer，TC)是內分泌器官最常見的惡性腫瘤[1]，其發病率最近一直在穩步上升[2-3]。間變性甲狀腺癌(anaplastic thyroid cancer，ATC)是甲狀腺疾病中最具攻擊力的類型。根據Ain等[4]報道，盡管ATC在所有甲狀腺腫瘤中的發病率不到2%，卻導致14%～39%的TC相關死亡病例。ATC對大多數傳統療法有抵抗力，并且對放射碘治療無效[5]。因此，有必要揭示TC的進展機制并尋找抑制因子。某些微小RNA(miRNA)已被證實具有抑癌作用，具抑制TC發生和轉移的能力[6-7]。Wang等[8]表明，與正常甲狀腺組織和細胞系比較，乳頭狀甲狀腺癌(papillary thyroid cancer，PTC)組織和甲狀腺癌細胞中miR-143-3p的表達明顯降低，Jahanbani等[9]揭示miR-143-3p表達的下調可能與經典PTC中的攻擊行為有關。TGF-β誘導因子同源框2(TGF-β-induced factor homeobox 2，TGIF2)屬于TALE同源域蛋白家族，TGIF2通過與TGF-β/BMP途徑相互作用或直接與DNA結合而充當轉錄抑制因子[10-11]。研究表明TGIF2在非小細胞肺癌和骨肉瘤中的表達均上調并起到促癌作用[12-13]。本研究檢測miR-143-3p在不同ATC細胞中的表達量，分析miR-143-3p和TGIF2的靶向關系，并通過上調miR-143-3p探究其在TC發展進程中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

2，7-二氯二乙酸酯(DCFH-DA)購自Sigma；DMEM細胞培養液和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自Invitrogen；反轉錄試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；TRIzol試劑、RIPA裂解液、BCA試劑盒、ECL顯色液和免疫組化試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；β-actin、TGIF2、P65、p-P65、LGR5和OCT4抗體購自Abcam；雙熒光素酶報告系統購自Promega；IL-6、IL-1β和iNOS ELISA試劑盒購自R&D；SOD測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；miR-143-3p mimic和其陰性對照miR-NC、pcDNA-TGIF2和其陰性對照pcDNA均由上海吉瑪公司合成；FACScan流式細胞儀購自Beckman Coulter；光學顯微鏡和倒置熒光顯微鏡購自Olympus；Nanodrop 2000購自中國賽默飛世爾公司。

1.2 分組和模型建立

16只18～20 g的SPF級4周齡BALB/c裸鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號為：SCXK(京)2016-0011。所有實驗操作程序均經過保定市第二醫院實驗動物倫理委員會批準，批準號：IACUC-20190423-17。將裸鼠飼養于SPF環境中，房間溫度控制在22～25 ℃，相對濕度50%～60%，晝夜交替12 h/12 h，自由飲水進食，適應性喂養一周后進行實驗。將BALB/c裸鼠隨機分為miR-NC和miR-143-3p mimic組，TC細胞CAL-62分別轉染miR-NC或miR-143-3p mimic，并將細胞密度調整至5×106個/mL進行皮下注射。連續飼養30 d，每5天記錄一次小鼠腫瘤體積，30 d后處死小鼠，取出腫瘤團塊稱質量并進行石蠟包埋切片，將石蠟切片脫蠟，檸檬酸鈉緩沖液修復，滴加一抗至切片4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃ 1 h，滴加HRP標記的鏈酶蛋白親和素，37 ℃作用 40 min，洗滌后避光顯色并用蘇木素復染細胞核。封片后使用光學顯微鏡觀察OCT4陽性細胞。

將CAL-62細胞分為以下6組，即：對照組、miR-NC、miR-143-3p mimic、pcDNA、pcDNA-TGIF2和miR-143-3p+TGIF2。

1.3 細胞培養及轉染

人甲狀腺上皮細胞TEC、人TC細胞CAL-62、KMH-2及8505C均購自美國菌種保藏中心(ATCC)，將細胞在含有10%FBS，100 U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素的DMEM中于37 ℃、含5%CO2濕潤條件下培養。將CAL-62細胞分為對照組、miR-NC組、miR-143-3p mimic組、pcDNA組和pcDNA-TGIF2組及miR-143-3p mimic+pcDNA-TGIF2共轉染組，按分組轉染對應序列，所有轉染均使用lipofectamine 2000進行，轉染后48 h收獲細胞用于后續實驗。

1.4 Real-time PCR檢測基因表達

用TRIzol試劑從TEC細胞、TC細胞、轉染的CAL-62細胞和瘤組織中提取總RNA，用Nanodrop 2000測定RNA的純度和濃度。取等質量的總RNA作為模板，使用反轉錄試劑盒轉錄成cDNA，以cDNA為模板，PCR擴增循環為：預變性95 ℃、3 min，變性95 ℃、15 s，退火60 ℃、30 s，延伸72 ℃、30 s，35個循環，終延伸72 ℃、5 min。

1.5 Western blot檢測蛋白表達

將CAL-62細胞轉染48 h后，RIPA試劑抽提細胞中總蛋白，BCA定量，點樣30 μg/孔， SDS-PAGE分離并轉膜至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉PVDF膜后加一抗4 ℃孵育過夜，第2天加二抗室溫孵育2 h，ECL顯色液顯色，凝膠成像儀進行相對定量。

1.6 雙熒光素酶報告基因分析

生物信息學預測網 (https://cm.jefferson.edu/rna22/Interactive/) 分析miR-143-3p與TGIF2 3′UTR之間的結合位點。構建TGIF2 Lentireporter-luciferase野生型和突變型載體，實驗分組為：TGIF2 3′UTR wt + miR-NC、TGIF2 3′UTR wt + miR-143-3p mimic、TGIF2 3′UTR wt+miR-143和TGIF2 3′UTR wt+miR-143-3p mimic。將3×104個 CAL-62細胞接種并培養到24孔板中，按分組共轉染。轉染24 h后，根據Dual-Luciferase?Report報告基因試劑盒說明書檢測海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶的活性。

1.7 細胞檢測

CAL-62細胞轉染后，根據 ELISA 試劑盒說明書對細胞上清液中誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、白細胞介素(interleukin,IL)-1β和IL-6水平進行檢測。

CAL-62細胞轉染后，用PBS沖洗細胞兩次，加入裂解緩沖液，0～4 ℃勻漿30 min后，將裂解產物在4 ℃、12 000 g離心15 min，收集上清液，按照說明書檢測超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的含量。

轉染后，將5 ×104個CAL-62細胞接種在96孔板中，在37 ℃、5%CO2培養48 h后，用PBS洗滌后，將細胞與10 μmol/L的DCFH-DA在37 ℃黑暗中孵育30 min。熒光顯微鏡下觀察DCFH-DA密度(綠色熒光)并拍照統計。

1.8 球體形成測定

轉染后，將2×103個CAL-62細胞接種于超低附著24孔板中，在DMEM/F-12培養基 (含有10 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF、1% B27、5 μg/mL 胰島素和0.03% LA717) 中培養10 d后，顯微鏡下拍照，并使用Image J軟件手動計算球體直徑大小。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 TC細胞中miR-143-3p的表達下調

與TEC組相比，人TC細胞CAL-62、KMH-2和8505C 中miR-143-3p的表達顯著下調(P<0.05)，見圖1。后續實驗選擇miR-143-3p表達最低的CAL-62細胞進行實驗。

圖1 人甲狀腺上皮細胞和不同TC細胞中miR-143-3p的表達

2.2 miR-143-3p與 TGIF2靶向關系驗證

如圖2A所示，生物學預測結果證明，TGIF2和miR-143-3p之間存在特異性結合位點。雙熒光素酶報告基因檢測結果表明，miR-143-3p mimic組對TGIF2 3′UTR mut的熒光素酶活性無明顯影響，但明顯降低TGIF2 3′UTR wt的熒光素酶活性(P<0.05，圖2A)。因此，TGIF2是miR143-3p的直接靶標。與對照組相比，miR-143-3p mimic組miR-143-3p的表達顯著升高(P<0.05)，miR-NC無統計學差異(圖2B)。與對照組相比，miR-143-3p mimic組TGIF2 mRNA表達明顯降低(P<0.05)，pcDNA-TGIF2組TGIF2 mRNA表達顯著升高(P<0.05)，miR-NC組和pcDNA組無統計學意義；與pcDNA-TGIF2組相比，miR-143-3p+TGIF2組TGIF2 mRNA表達明顯降低(P<0.05，圖2C)。TGIF2蛋白的表達趨勢與mRNA表達一致(圖2D、圖2E)。

圖2 CAL-62細胞中miR-143-3p和TGIF2靶向關系驗證及其表達

2.3 過表達miR-143-3p通過對TGIF2的負調控抑制炎癥因子的分泌

與對照組比較，miR-143-3p mimic組細胞上清液中iNOS、IL-1β和IL-6含量明顯減少(P<0.05)，P65磷酸化水平降低(P<0.05)，pcDNA-TGIF2組細胞上清液中iNOS、IL-1β和IL-6含量明顯增加(P<0.05)，P65磷酸化水平升高(P<0.05)；與pcDNA-TGIF2組比較，miR-143-3p+TGIF2組逆轉了過表達TGIF2導致的炎癥因子水平上調和P65磷酸化水平升高(見圖3)。

圖3 miR-143-3p負調控TGIF2對炎癥因子表達的影響

2.4 過表達miR-143-3p通過對TGIF2的負調控增強氧化應激反應

如圖4所示，與對照組相比，miR-143-3p mimic組細胞中ROS含量明顯增加(P<0.05)，SOD含量明顯減少(P<0.05)，pcDNA-TGIF2組結果與之相反；與pcDNA-TGIF2組相比，miR-143-3p和 TGIF2共轉染組細胞中ROS含量明顯增加(P<0.05)，SOD含量明顯減少(P<0.05)。

圖4 miR-143-3p負調控TGIF2對ROS和SOD產生的影響

圖5 miR-143-3p負調控TGIF2對甲狀腺癌細胞的干細胞樣特性的影響

2.5 過表達miR-143-3p通過對TGIF2的負調控抑制TC細胞的干細胞樣特性

與對照組相比，miR-143-3p mimic組癌細胞成球直徑明顯變小(P<0.05)，pcDNA-TGIF2組癌細胞球體直徑明顯變大(P<0.05)；與pcDNA- TGIF2組比較，miR-143-3p+TGIF2組癌細胞成球直徑變小(P<0.05)。與對照組相比，miR-143-3p mimic組CAL-62細胞中LGR5和OCT4蛋白表達顯著下調(P<0.05)，pcDNA-TGIF2組LGR5和OCT4蛋白表達顯著上調(P<0.05)；與pcDNA-TGIF2組比較，miR-143-3p+TGIF2組LGR5和OCT4蛋白表達顯著下調(P<0.05)。

2.6 過表達miR-143-3p通過對TGIF2的負調控制抑裸鼠體內移植瘤的生長

與miR-NC組相比，miR-143-3p mimic組移植瘤質量和體積明顯減小(P<0.05)，且瘤組織中miR-143-3p表達明顯上調(P<0.05)，TGIF2表達明顯下調(P<0.05)，OCT4陽性細胞數目明顯減少(P<0.05)如圖6所示。

圖6 miR-143-3p對裸鼠腫瘤形成的影響

3 討論

越來越多的證據表明，甲狀腺腫瘤中miRNA失調與TC的發生密切相關[14-15]，miR-199a-5p通過靶向Snail信號抑制ATC細胞的上皮間質轉化[16]。miR-143-3p在PTC中的表達降低，并通過靶向MSI2誘導癌細胞凋亡并抑制細胞的增殖、侵襲和遷移[8]。TGIF2通常通過充當microRNA的靶標而參與癌癥的治療[17-18]。本研究結果表明，miR-143-3p在不同的ATC細胞中的表達降低，與之前結果一致。通過生物信息學預測和雙熒光素酶報告分析結果證實TIGF2是miR-143-3p的直接靶標，miR-143-3p負調控TIGF2的表達，抑制裸鼠移植瘤的生長及癌細胞干細胞樣特性從而抑制ATC的發展。

慢性炎癥在癌癥發展中起著至關重要的作用，炎癥不僅起著腫瘤促進劑的作用，而且還通過誘導DNA損傷、血管生成、侵襲和轉移而影響腫瘤發生的其他進程[19-20]。miRNA通過調節炎癥來驅動腫瘤進展[21-22]，miR-143-3p表達的上調可通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路來改善肺炎性因子水平并減少肺炎支原體小鼠肺泡上皮細胞凋亡[23]。結果表明，過表達miR-143-3p可明顯降低促炎因子iNOS、IL-1β和IL-6的表達水平，并下調NF-κB-p65蛋白磷酸化水平。因此，miR-143-3p可通過抑制炎癥反應阻止腫瘤的惡性發展。

凋亡是根除癌前細胞和癌細胞的主要機制，可以用作癌癥藥物開發研究的重要靶標[24]。ROS的過度生成導致癌細胞氧化還原穩態的破壞[25]，降低細胞內抗氧化劑水平，并增加脂質過氧化水平，促進癌癥的早期凋亡[26]。SOD將有害的超氧化物自由基轉化為過氧化氫和分子氧，隨后被過氧化氫酶催化轉化為水[27]。本研究結果表明，miR-143-3p過表達可明顯增加ROS的產生，降低SOD水平。因此，miR-143-3p可通過破壞癌細胞中氧化還原的穩態誘導癌細胞凋亡阻滯癌癥進程。

癌癥干細胞(cancer stem cell，CSC)是能夠引發新腫瘤的腫瘤細胞亞群[28]，是腫瘤內異質性的主要原因[29]。TGIF2可以增強OCT4的轉錄以調節卵巢癌細胞的干細胞樣特性[30]，LGR5和OCT4是CSC的標志物[31]。本研究中miR-143-3p mimic明顯逆轉過表達TGIF2誘導的TC干細胞團塊直徑的增大以及LGR5和OCT4蛋白的上調。因此，miR-143-3p可通過抑制TC細胞干樣特性阻止癌癥惡化。

綜上所述，miR-143-3p通過對促癌基因TGIF2的負調控抑制ATC細胞炎癥因子的分泌和干細胞樣性，誘導氧化應激反應促進癌細胞凋亡，并抑制體內腫瘤的生長，從而起到抗癌作用。本研究結果表明miR-143-3p可能是治療ATC的一個有希望的分子靶標。