基于“腎藏精起亟”理論觀察補腎活血復方通過干預klotho改善心梗后心衰大鼠心肌纖維化

劉賢嫻，張艷，徐瑤，孫曉寧，鄒文聰，申欣宜，王雅琴

1 遼寧中醫藥大學 遼寧沈陽 110847

2 遼寧中醫藥大學附屬醫院 遼寧沈陽 110032

心力衰竭是一種臨床表現極為復雜的綜合征，提示心臟作為泵的效率受損[1]。根據病情發展的時間和速度，劃分為急、慢性心衰，臨床上常見患者急性心衰住院治療后癥狀緩解，轉歸為慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）[2]。CHF是由各種致病因素的影響下，導致心室充盈和 （或）射血能力受損而引起的一組綜合征，是各種心血管系統疾病的終末階段[3-4]，是全球公共衛生的一大難題。已有研究證明引起CHF的最常見原因是心肌梗死（MⅠ），MⅠ主要是由心室重構引起的病變，而心室重構的基礎病理是心肌纖維化[5]。臨床治療CHF基本依靠藥物，西醫中的代表藥物是卡托普利，但有研究指出西藥對心肌梗死后纖維化能夠起到改善的作用，但效果不顯著，且容易反復發作[6]。

本研究通過觀察補腎活血復方對CHF大鼠干預后，心功能、心、腎組織蛋白及纖維化的變化，證實本方對心梗后心衰大鼠心肌纖維化很好的預防作用，為中醫藥治療CHF提供了新的策略。

材料與方法

1 實驗材料

1.1 藥物 補腎活血復方，主要成分：菟絲子、黃精、黃芪、丹參、人參、紅花、益母草、三七，成品由遼寧中醫藥大學附屬醫院藥劑中心提供。卡托普利片，規格：25mg*100片（旭東海普藥業，H31020564）。

1.2 動物 12周齡雄性WKY大鼠60只，體重（200±20）g（遼 寧 長 生 生 物，SCXK（遼）2015-0001）。嚴格按照SPF級別飼養。

1.3 主要試劑及儀器 RⅠPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（索萊寶）；蛋白質電泳、轉印緩沖液（北京酷來搏）；ECL顯色試劑盒（美國GE公司）；Klotho一抗、內參GAPDH一 抗、Col 1a1一 抗、二 抗 羊 抗兔ⅠgG-HRP（美國Abcam公司）；德國LeicaPJ-1A型烤片機（天津天利航空機電有限公司）；MS-2000多媒體化生物信號記錄分析系統（龍飛達科技有限公司）等。

2 實驗方法

2.1 CHF大鼠造模 大鼠麻醉成功后，連接心電圖，并記錄術前心電圖（圖1）。再行左冠狀動脈前降支結扎術，我們可以看到局部收縮力降低，且心肌由紅色變為白色，心電圖顯示ST段明顯抬高[7， 8]（圖2），證明成功造成心梗模型。Sham組顯露冠脈后僅掛線不結扎。術后7d內，每天都予以4組常規飼料喂養，同時予以青霉素鈉5萬單位，預防感染。從第14～28天的飼料減至常規喂養量1/2，配合每天1次的力竭式游泳訓練。造模結束后要及時做檢測心臟彩超，射血分數≤60，則代表造模成功[9]。

圖1 大鼠冠狀動脈結扎前心電圖

圖2 大鼠冠狀動脈結扎后心電圖

2.2 分組與藥物治療 造模成功后，Sham組死亡4只，剩余11只，實驗組45只大鼠死亡16只，剩余29只，將29只大鼠隨機分為Model組9只，BSHX組10只，Captopril組10只。每組灌胃劑量為3 mL·（2次）-1·天-1，Sham組和Model組予等容積去離子水灌胃。BSHX組給予補腎活血復方，劑量為9.2g·kg-1·d-1（因本課題前期實驗已經探究出此劑量的中藥制劑治療CHF效果最佳，故使用此劑量）。Captopril組給予卡托普利片配置成的混懸液灌胃，劑量為12.5 mg·kg-1·d-1。以上4組均連續用藥或蒸餾水4周。

2.3 標本采集

2.3.1 超聲檢測大鼠心功能 各組大鼠用藥或去離子水28d后行心臟超聲檢測。將大鼠麻醉固定后，用超聲機的探頭置于大鼠心前區，測出LVDD和LVDS值并算出EF和FS值。

2.3.2 Wb法檢測心、腎組織中klotho及Col 1a1蛋白的表達 所有大鼠處死后立即取出200μg心肌及100μg腎組織，將其充分剪碎后加入RⅠPA裂解液，從中提取蛋白，電泳后將蛋白轉移到膜上。漂洗后封閉1h，洗膜3次；洗滌后加入分別加入klotho及Col 1a1一抗稀釋液，4℃孵育過夜后洗膜3次；加入二抗稀釋液后重復以上步驟，最后通過ECL觀察并分析結果。

2.3.3 心肌細胞形態觀察 將每組大鼠的心肌組織用多聚甲醛固定，石蠟包埋切片、脫蠟、HE染色等步驟，鏡下觀察心肌細胞的形態變化。

3 統計學方法

應用SPSS20.0統計學軟件進行分析，數據都表示為均數±標準差（±s），采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗，結果中P＜0.05為差異具有統計學意義。

結 果

1 補腎活血復方對大鼠心臟超聲的影響

與Model組 比 較，Sham組 大 鼠LVDD、LVSD、EF、FS有顯著性差異（P＜0.05）。BSHX組和Captopril組經治療后，LVDD、LVSD、FS均有顯著改善，EF值高于Model組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1，圖3、4。

圖3 Sham組大鼠常規喂養4周后心臟彩超

表1 BSHX對大鼠心臟超聲的影響（±s）

表1 BSHX對大鼠心臟超聲的影響（±s）

注：與Sham組比較aP＜0.05；與Model組比較bP＜0.05。

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3.2 補腎活血復方對大鼠心、腎組織中klotho蛋白和心肌中Col 1a1蛋白表達的影響 與Sham組相比，Model組心、腎組織中klotho蛋白含量減少，心肌中Col 1a1蛋白含量增多，差異有統計學意義（P＜0.05）。與Model組比較，BSHX組和Captopril組心、腎組織中klotho蛋白含量增多，心肌中Col 1a1蛋白含量減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2，圖5。

圖5 大鼠心、腎組織中klotho蛋白和心肌中Col 1a1蛋白的表達

表2 BSHX對大鼠心、腎組織中klotho蛋白和心肌中Col 1a1蛋白表達的影響（±s）

表2 BSHX對大鼠心、腎組織中klotho蛋白和心肌中Col 1a1蛋白表達的影響（±s）

注：與Sham組相比aP＜0.05；與Model組相比bP＜0.05。

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圖4 Model組大鼠常規喂養4周后心臟彩超

3.3 補腎活血復方對大鼠心肌細胞纖維化的結果在HE染色中顯示，Sham組心肌細胞排列整齊，纖維走行正常。但Model組心肌纖維走行混亂，纖維斷裂、缺失，表明心肌嚴重損傷；BSHX組和Captopril組緩解了以上的癥狀，走行逐漸有序，纖維重組。見圖6。

圖6 大鼠心肌細胞形態

討 論

在實驗中我們采用左冠狀動脈前降支結扎術，因為此結扎術實驗操作復雜，手術要求較高，但展現的結果與人類的心肌纖維化最相似，是現在較為公認的CHF模型[10]，本課題增加了配合力竭式運動，加重了心衰程度，并加快了病程發展，經心電圖可以看到ST段明顯抬高，并且觀察到大鼠活動狀態變差，甚至伴有明顯的哮鳴音，判斷成功給大鼠建立了CHF模型。在我們課題的前期研究中也證實，補腎活血復方可以通過上調心、腎中klotho蛋白的表達，達到阻止心衰發展的目的[11]，所以此次實驗加用了wb法檢測ColⅠ蛋白，來進一步觀察心肌纖維化的程度，并聯系“腎藏精起亟”理論進一步理解補腎活血復方在慢性心衰中的治療思路，為中西醫在治療CHF上提供新的治療靶點。

心臟纖維化定義為細胞外基質（ECM）產生和降解的失衡，從而在許多心臟病理生理狀況中導致心臟功能障礙[12]。CHF引起了異常的容量和壓力負荷，導致了心肌細胞長期缺血，發生了順應性改變，還有研究證明心肌纖維化會加重心力衰竭的程度[13-14]，所以改善心肌細胞纖維化對CHF患者預后的關鍵一步。而心肌纖維化是由成纖維細胞對纖維膠原蛋白轉換的調節改變而引起的，這促進了心肌間質內和心肌內血管周圍的Ⅰ型膠原蛋白（Col 1a1）纖維的過度沉積[15]。

Klotho基因（又稱α-klotho）首次被Kuroo， M.等人（1997）確定為小鼠抗衰老基因[16]。但其實Klotho家族是由α-klotho、β-klotho和γ-klotho三類基因組成，其中α-klotho和β-klotho基因都編碼膜結合蛋白和分泌蛋白[17]，本文章內所研究的klotho即為α-klotho。大量先前的研究已經表明，klotho基因參與了發生與多種人類疾病的發展，包括慢性腎臟疾病、動脈硬化癥、心肌肥大、糖尿病和肥胖、以及各種類型的癌癥[18]。LV等[19]研究發現Klotho是一種具有腎臟和心臟保護作用的抗衰老蛋白，Klotho過表達可通過滅活NF-kB通路減輕心衰和腎損傷。Chen等[20]則認為分泌的Klotho通過激活Nrf2促進谷胱甘肽還原酶（GR）的表達，GR心臟特異性過表達減弱了心肌纖維化。已有實驗證明在慢性心衰大鼠中，Klotho mRNA的表達與Col 1a1 mRNA的表達存在負相關的關系，兩者可能存在互相調節的關系[21]。Klotho通過減少TGF-β1的數量，間接抑制microRNA-132的表達[22]，它抑制atrogin-1表達所必需的轉錄因子FOXO3。這個F-box蛋白激活了心肌細胞鈣調神經磷酸酶的泛素化和降解，而過量的鈣調神經磷酸酶刺激NFAT，激活了NFAT的下游基因促纖維化基因的表達。因此，klotho通過抑制microRNA-132來限制心肌纖維化的發展[23]。

中醫認為CHF屬于“胸痹”“心悸”“怔忡”等范疇，臨床中常有胸痛、胸悶、氣短、心悸、下肢浮腫等臨床表現[24-25]。張艷教授提出了“腎藏精起亟”理論治療CHF，《中醫基礎理論》中也提到，“精”是人體的原始物質，是生命活動的本原。同時在《素問·六節藏象論》中也提及：“腎者， 主蟄， 封藏之本， 精之處也。”充分說明了腎對精的蟄伏和閉藏作用。程士德：“亟，急也。又頻數也。”在古，極通亟，如今部分學者認為“起亟”即為應付各種緊急或極端的變化，應激反應時人體會分泌大量的腎上腺皮質激素來應對緊急情況[26]。腎精虧虛時，一方面血化失源，心主身之血脈，化赤行血；另一方面無以生血，心血不足，心脈失于濡養，出現心悸、胸痛、氣短等癥狀。王長江等[27]人從“腎藏精”角度論證了Klotho基因的表達與腎精的興衰成相關性，認為Klotho是腎精的組成部分。張艷教授正是從補腎益精、活血利水的治療原則出發，擬出補腎活血復方，方中以人參、黃芪為君藥，正反、陰陽互用，共奏扶正、補血、行氣之功；丹參、紅花、三七為臣，活血化瘀；菟絲子、黃精補益腎精；益母草活血利尿。

綜上所述，治療心肌纖維化對慢性心力衰竭患者是極其關鍵的一步，在西醫上主要是運用沙坦類、他汀類等降壓降脂方式來緩解纖維化程度，并沒有公認的抗纖維化的藥物。對比之下，補腎活血復方提高了klotho蛋白的表達，同時降低了心肌纖維化的程度，以達到改善CHF的目的，但具體機制還需要進一步研究。