嗜水氣單胞菌雙組分系統EnvZ/OmpR功能探究

馬世林，李繼紅，馬倩倩，吳志豪，陳愿，張永安,3,4，周洋,3

1.華中農業大學水產學院，武漢430070； 2.中國科學院水生生物研究所，武漢430072； 3.嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室，廣州 510642；4.長江經濟帶大宗水生生物產業綠色發展教育部工程研究中心，武漢430070

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)屬于革蘭氏陰性菌，是一種重要的條件致病菌[1]。該菌在自然界廣泛分布，由其引起的魚類出血性敗血癥(MAS)給水產養殖業帶來了嚴重的經濟損失[2]。嗜水氣單胞菌的主要毒力因子包括胞外毒素(氣溶素、溶血素、腸毒素等)、胞外蛋白酶(金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶等)和黏附因子(S蛋白、菌毛、外膜蛋白等)等[3-4]。研究表明，嗜水氣單胞菌致病過程包含多個毒力因子的協同作用[5]，因此，解析嗜水氣單胞菌毒力因子的協同和調控機制顯得尤為重要。

雙組分系統(two-component system,TCS)是細菌感受、響應和適應環境改變或自身胞內狀態的一種信號轉導機制，細菌感應的信號包括細菌細胞自身的氧化還原狀態、營養狀況、外界環境的滲透壓和抗生素濃度等[6-7]。EnvZ/OmpR系統是經典的雙組分系統之一，可響應外界滲透壓的變化，其中EnvZ是定位于細胞膜上的組氨酸蛋白激酶，OmpR是位于細胞質中具有轉錄活性的反應調控因子，EnvZ感應到外界信號后，通過磷酸基團轉移將信號傳遞給OmpR，進而調節下游外膜孔蛋白OmpF和OmpC的轉錄[8]。有研究者發現鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)EnvZ/OmpR雙組分系統在細菌滲透壓調節、運動和毒力調控上發揮關鍵作用[9]。致病性大腸桿菌(pathogenicEscherichiacoli)雙組份系統EnvZ/OmpR下游基因ompF和ompC缺失后顯著影響細菌對宿主的侵襲、定植和黏附能力[10]。目前，嗜水氣單胞菌中雙組分系統EnvZ/OmpR的功能未知，本研究通過同源重組的方法構建了雙基因缺失株ΔenvZ/ompR，探究雙組分系統EnvZ/OmpR是否影響嗜水氣單胞菌生物被膜形成、抗血液殺傷、全身性侵襲性擴散等過程，旨在為闡明EnvZ/OmpR在嗜水氣單胞菌致病過程中發揮的功能提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 菌株和實驗試劑

嗜水氣單胞菌野生株ZYAH72于2014年分離自湖北荊州某漁場患病鯽，由筆者所在實驗室保存，NCBI序列號為NZ_CP016989.1。大腸桿菌χ7213感受態及自殺質粒pRE112均為筆者所在實驗室保存。草魚腎細胞CIK細胞系(grass carp kidney cell line，CVCL_CV32)由筆者所在實驗室保存并傳代，在含10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素-鏈霉素雙抗的M199培養基中培養。

胎牛血清和M199培養基購自Gibco公司；PrimeSTAR Max DNA聚合酶、限制性內切酶、DNA Marker購自諾唯贊公司；所有抗生素(青霉素-鏈霉素雙抗和氯霉素)均購自海博生物試劑公司；逆轉錄試劑盒GoScriptTMReverse Transcription System購自美國Promega公司；熒光定量PCR檢測試劑盒(SYBR Green PCR master mix)購自美國Bio-Rad公司；試驗中使用的引物(表1)，均由擎科生物技術有限公司合成。

表1 引物信息 Table 1 Primers information

1.2 ΔenvZ/ompR缺失株的構建

ΔenvZ/ompR缺失株構建策略如圖1所示，以嗜水氣單胞菌ZYAH72全基因組為模板，用P1/P2和P3/P4引物分別進行PCR以擴增上下游同源臂，再用P1/P4引物經融合PCR連接上下游同源臂。經XbaⅠ和SacⅠ雙酶切后連接到自殺性質粒pRE112對應多克隆位點，然后轉化至大腸桿菌χ7213。將構建的χ7213-pRE112-envZ/ompR作為供體菌，嗜水氣單胞菌ZYAH72作為受體菌，進行接合轉移。具體操作如下：供體菌和受體菌分別培養至對數生長期，用無菌PBS洗滌2次后混合均勻。將混合液小心加到提前放置在無抗LA平板上的無菌硝酸纖維素膜上，28 ℃靜置6 h后用LB培養基沖洗，適當梯度稀釋后涂布于氯霉素抗性平板上。28 ℃培養待結合子長出后，用P1/P4引物進行PCR驗證。驗證為陽性的單交換子在7%蔗糖LB培養基中連續傳代后檢測氯霉素抗性。對于氯霉素敏感菌株用P5/P6引物進行PCR驗證，PCR鑒定結果為陰性即表明ΔenvZ/ompR缺失株構建成功。

圖1 ΔenvZ/ompR缺失株構建策略Fig.1 Construction strategy of ΔenvZ/ompR

1.3 NaCl脅迫實驗

分別配制含有0.25%、1.00%、2.00% NaCl的培養基，將嗜水氣單胞菌以體積比1∶100轉接到鹽脅迫培養基中，混勻后轉接至96孔板，每孔200 μL，每個樣品3個重復。28 ℃條件下培養，每0.5 h測OD600 nm值，連續培養30 h。實驗獨立重復3次。

1.4 qRT-PCR檢測相關基因表達

使用TaKaRa反轉錄試劑盒(PrimeScript TMRT Kit)進行反轉錄，2×TSINGKE Master qPCR Mix-SYBR進行熒光定量PCR。其中嗜水氣單胞菌ZYAH72的內參為16S rRNA，草魚的內參為β-actin。實驗獨立重復3次，分析方法采用2-ΔΔCt法[11]。

1.5 生物被膜生成量檢測

取10 μL菌液和100 μL LB至96孔板中，28 ℃培養36 h。吸出菌液并用無菌水洗去未附著菌體，用100 μL 0.2%結晶紫染色5 min。無菌水洗滌后放置于37 ℃培養箱烘干，用33%冰醋酸溶解生物被膜，分光光度計測定每孔的OD600 nm值。實驗獨立重復3次。

1.6 全血殺傷實驗

采集健康成年草魚血液，用EDTA作抗凝處理，調節菌濃度為105CFU/mL，菌和血液以體積1∶9比例混勻置于28 ℃培養箱靜置培養。作用1 h后取100 μL菌-血液混合物，使用無菌PBS進行10倍梯度稀釋后涂布平板，28 ℃培養箱中過夜培養，第2天進行菌落計數。

1.7 斑馬魚攻毒實驗

斑馬魚購自武漢東湖生態旅游風景區萬物生水族經營部，于華中農業大學水產基地暫養1周后進行攻毒實驗。根據菌落計數的結果，用PBS將生長至對數生長期的嗜水氣單胞菌洗滌2次，置于冰上備用。注射感染組斑馬魚用無菌注射器經腹腔注射，設置6個攻毒濃度，每組10尾斑馬魚，每尾10 μL，同時注射PBS組作為空白對照。浸泡感染組的斑馬魚背鰭前方小片鱗片用手術刀片刮掉，分別浸泡在6個濃度梯度菌液的魚缸中，20 min后撈出并用曝氣水清洗，放到干凈水源的魚缸中。設置刮傷后PBS浸泡組為空白對照組。所有斑馬魚感染后持續觀察14 d，記錄死亡數據，采用Karber法計算LD50[12]。

1.8 草魚攻毒實驗

試驗用草魚(體質量20±10 g、體長8～10 cm)購自湖北仙桃市某草魚養殖基地，于華中農業大學水產基地暫養1周后進行攻毒實驗。草魚感染劑量為2.0×105CFU/尾。感染24 h后，解剖草魚后取脾臟、頭腎和體腎組織，分別稱取其質量。向組織中加入1 mL的PBS，使用研磨棒研磨組織獲得懸浮液，涂布平板進行菌落計數，最后計算出每克組織中的載菌量。

2 結果與分析

2.1 嗜水氣單胞菌雙組分系統envZ/ompR基因組分析及ΔenvZ/ompR缺失株構建

對嗜水氣單胞菌ZYAH72全基因組序列分析，發現envZ/ompR的同源序列，將其命名為envZ/ompR(BFW97_22565/ BFW97_22560)。為進一步研究envZ/ompR功能，通過同源重組法構建envZ/ompR雙基因缺失株，通過基因外部引物(P1/P4)PCR擴增，野生型獲得3 080 bp產物，ΔenvZ/ompR產物為1 205 bp，通過基因內部引物(P5/P6)PCR擴增，野生型獲得535 bp產物，ΔenvZ/ompR無對應片段因此無法獲得擴增產物，結果均與預期一致，表明ΔenvZ/ompR缺失株構建成功(圖2)。

泳道1、3為野生型ZYAH72擴增產物，泳道2，4為缺失株envZ/ompR擴增產物，泳道1、2引物為外引物P1/P4，泳道3、4引物為內引物P5/P6。Lanes 1 and 3 are the amplified products of wild-type ZYAH72,lanes 2 and 4 are the amplified products of ΔenvZ/ompR,the primers of lanes 1 and 2 are P1/P4,and the primers of lanes 3,4 are P5/P6.

2.2 雙組分系統EnvZ/OmpR對ompF和ompC基因的轉錄調控

滲透脅迫實驗結果顯示，在低滲(0.25% NaCl)、等滲(1.00% NaCl)和高滲(2.00% NaCl)LB培養基中ΔenvZ/ompR與野生株生長速度無顯著性差異(圖3)。對下游ompF和ompC基因轉錄水平的檢測結果顯示，野生型菌株在低滲(0.25% NaCl)條件較等滲(1.00% NaCl)條件下ompF的轉錄水平上調了64.6%，envZ/ompR缺失后，ompF的轉錄水平顯著被抑制(圖4)。在高滲(2.00% NaCl)條件下，野生型菌株ompC的轉錄水平較等滲(1.00% NaCl)條件上調了48.2%，而envZ/ompR缺失后，ompC的上調表達被顯著抑制(圖5)。

A:0.25% NaCl; B:1.00% NaCl; C:2.00% NaCl.圖3 細菌在不同NaCl質量分數LB培養條件下的生長曲線Fig.3 Growth curve of bacteria cultured in LB medium with different NaCl concentration

圖4 ompF在不同NaCl質量分數LB培養條件下的轉錄水平Fig.4 Transcription level of ompF under differentNaCl concentration LB culture conditions

圖5 ompC在不同NaCl質量分數LB培養條件下的轉錄水平Fig.5 Transcription level of ompC under different NaCl concentration LB culture conditions

2.3 雙組分系統EnvZ/OmpR在嗜水氣單胞菌生物被膜形成和抗全血殺傷中的作用

通過檢測體外生成生物被膜的生成量，探究雙組分系統EnvZ/OmpR是否參與嗜水氣單胞菌生物被膜形成過程，結果顯示ΔenvZ/ompR的生物被膜形成能力較野生型下調19.9%(圖6)。此外，ΔenvZ/ompR在抗宿主免疫清除方面也表現出缺陷。野生型在與草魚全血孵育1.0 h后，細菌數量為起始菌量的3.82倍，而ΔenvZ/ompR被草魚全血有效殺傷，孵育1.0 h后菌量僅為起始菌量的90.1%(圖7)，表明envZ/ompR缺失后，細菌抗全血殺傷能力顯著下降。

圖6 生物被膜形成能力檢測Fig.6 Biofilm formation test

圖7 抗全血殺傷能力檢測Fig.7 Capacity of anti-whole blood killing assay

2.4 雙組分系統EnvZ/OmpR在嗜水氣單胞菌感染過程中的作用

斑馬魚攻毒實驗結果顯示，腹腔注射感染方式下，ΔenvZ/ompR的LD50相較野生型增長了1.80倍，而在創傷感染方式下，ΔenvZ/ompR的LD50相較野生型增長了4.80倍(表2)。進一步檢測野生株與ΔenvZ/ompR感染后分別在草魚內臟組織載菌量上的差異，結果顯示：在脾臟中，ΔenvZ/ompR的載菌量僅為野生株的5.5%；在體腎組織中，ΔenvZ/ompR的載菌量僅為野生株的11.3%；在頭腎組織中，野生載菌量為103CFU/g，而ΔenvZ/ompR的載菌量為0(圖8)。

表2 斑馬魚攻毒結果 Table 2 Zebrafish challenge results

圖8 草魚組織載菌量Fig.8 Bacterial loads in grass carp tissues

2.5 雙組分系統EnvZ/OmpR對于促炎性細胞因子表達的影響

野生株感染草魚后脾臟中TNF-α和IL-6的轉錄水平分別上調了154.6倍和84.5倍，而ΔenvZ/ompR感染組脾臟中，上述促炎細胞因子也上調表達，上調倍數分別為107.8倍和5.6倍；在肝臟中野生株感染后TNF-α和IL-6的轉錄水平分別上調了115.6倍和102.0倍，而缺失株感染組僅為52.6倍和24.6倍(圖9)。上述結果說明野生株感染后能夠引起草魚強烈的炎癥反應，而envZ/ompR基因缺失后降低了炎癥反應程度。

A：脾臟； B：腎臟； C：肝臟。A:Spleen; B:Kidney; C:Liver.圖9 草魚促炎細胞免疫因子的相對表達量Fig.9 Relative expression of pro-inflammatory cytokine of grass carp

3 討 論

自20世紀80年代起，嗜水氣單胞菌的流行病給全球水產養殖業造成了嚴重的經濟損失[13]。嗜水氣單胞菌的致病機制一直以來都是業內研究熱點。本研究通過同源比對，將ZYAH72(NZ_CP016989.1)菌株BFW97_22565/ BFW97_22560基因命名為envZ/ompR，成功構建了基因缺失株ΔenvZ/ompR，并初步分析了該基因的功能。

根據功能域分析推測雙組分系統EnvZ/OmpR可能和滲透脅迫有關，然而，實驗結果顯示缺失株滲透脅迫能力變化并不顯著。在基因功能預測時發現ZYAH72基因組中共有4對雙組分基因和滲透脅迫有關，推測envZ/ompR基因失活后其他雙組分系統代償了EnvZ/OmpR滲透脅迫的功能。為了驗證這個猜想，用qRT-PCR的方法檢測了下游滲透調控相關因子的表達變化，結果顯示，低滲條件下，外膜孔蛋白基因ompF受雙組分系統EnvZ/OmpR調控轉錄水平上調，而高滲條件下外膜孔蛋白基因ompC受雙組分系統EnvZ/OmpR調控轉錄水平顯著上調。上述結果與大腸桿菌中雙組分系統EnvZ/OmpR對于下游蛋白的調控結果一致[14]，表明嗜水氣單胞菌中EnvZ/OmpR與滲透脅迫響應相關，但因為在ZYAH72菌株中還存在其他功能類似的雙組分系統，這些雙組分系統如何協調互作，具體調控機制還有待進一步研究。

生物被膜與細菌抗生素抗性和致病性密切相關，生物被膜還可以作為細菌對外的屏障，有效抵御宿主殺傷[15-17]。之前的研究發現嗜水氣單胞菌QseB/C雙組分系統正向調節泳動及涌動、溶血活性和負向調節生物膜的形成，影響細菌毒力[10]。本研究發現雙組分系統EnvZ/OmpR正調控嗜水氣單胞菌生物被膜的形成和抗血液殺傷能力。

研究表明，鮑曼不動桿菌EnvZ/OmpR雙組分系統調控細菌的滲透壓和毒力[9]。此外，大腸桿菌雙組分系統下游基因ompF和ompC也被發現和細菌的定植、黏附能力及毒力有關[10]。本研究測算了ΔenvZ/ompR的斑馬魚LD50，發現腹腔感染后缺失株毒力和野生株毒力差異并不明顯。然而刮傷感染結果顯示ΔenvZ/ompR毒力有明顯下降，提示EnvZ/OmpR在嗜水氣單胞菌由皮膚創口向全身系統擴散過程發揮作用。為進一步驗證這一結論，用草魚構建感染模型檢測了組織載菌量，ΔenvZ/ompR感染草魚后各臟器的載菌量相比于野生株顯著降低，表明EnvZ/OmpR促進細菌的全身侵襲能力。在實際生產中，魚體體表傷口也是嗜水氣單胞菌感染的途徑之一。最后我們還發現，ΔenvZ/ompR感染引起的宿主促炎細胞因子TNF-α和IL-6表達量減少，過多的炎性細胞因子產生會導致組織損傷、器官衰竭甚至最終死亡。因此，上述結果也與ΔenvZ/ompR致病力的結果相一致。

綜上，本研究初步探究了嗜水氣單胞菌雙組分系統EnvZ/OmpR的功能，發現其參與響應滲透脅迫，參與調控生物被膜形成，且在致病過程尤其是宿主體內系統擴散過程發揮重要作用，這一結果可為嗜水氣單胞菌致病調控機制的研究提供科學依據。