豬δ冠狀病毒的分離鑒定及其遺傳進化分析

方譜縣，劉康，張蕙暢，夏思進，張健淞，任杰，肖少波，方六榮

華中農業大學農業微生物學國家重點實驗室/華中農業大學動物醫學院/湖北省生豬健康養殖協同創新中心，武漢 430070

豬δ冠狀病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)是近年來新發現的一種豬腸道致病性冠狀病毒，主要感染新生仔豬，臨床癥狀與豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)和豬傳染性胃腸炎(porcine transmissible gastroenteritis，TGE)相似，以腹瀉、嘔吐、脫水為主要特征[1-3]。自2014年初在美國暴發后，加拿大、韓國、中國、泰國、越南、老撾、日本等國家也相繼從豬腹瀉樣品中檢測到PDCoV，給養豬業造成了較大的經濟損失[4]。臨床上PDCoV常與其他病毒混合感染，比如PEDV、TGEV以及PRRSV[5-6]。最近研究表明PEDV和PDCoV混合感染比單一病毒感染具有更嚴重的臨床癥狀，這給腸道病毒的防控帶來很大的挑戰[7]。目前，尚無商品化的疫苗可用，病毒的分離培養對PDCoV診斷方法的建立和疫苗的研制及致病機制的研究具有十分重要的意義。

PDCoV為單股正鏈RNA病毒，基因組大小約為25.4 kb，屬于冠狀病毒科、δ冠狀病毒屬成員，具有其他冠狀病毒類似的基因分布(5′ UTR-ORF1a-ORF1b-S-E-M-NS6-N-NS7-NS7a-3′ UTR)。其中，ORF1a和ORF1b編碼2個多聚蛋白pp1a、pp1ab，被自身編碼的木瓜樣蛋白酶(nsp3)和3C樣蛋白酶(nsp5)加工成15個非結構蛋白；3′端基因組編碼4個結構蛋白[刺突蛋白(S)，小膜蛋白(E)，膜蛋白(M)，核衣殼蛋白(N)]以及3個輔助蛋白(NS6，NS7，NS7a)[8-10]。目前，PDCoV是唯一通過體外細胞培養成功分離的δ冠狀病毒屬成員，是研究δ冠狀病毒屬病毒的良好模型。研究發現PDCoV具有非常廣泛的宿主嗜性[11]，對牛、雞、小鼠以及火雞易感，甚至還可以感染人[12-15]，提示該病毒具有跨種傳播的能力，給動物和人類健康帶來危險。

PDCoV和PEDV都屬于不容易分離培養的病毒，在體外培養中往往需要添加外源性胰蛋白酶[16]。相對于PEDV，可在體外培養傳代的PDCoV毒株仍然很少，盡管近年來PDCoV生物學功能等基礎研究獲得較多的研究進展[17-19]，但是對該病毒的起源、進化以及具有廣泛的宿主嗜性的機制尚不清楚。因此，加大其流行病學調查、臨床上毒株的分離以及免疫致病機制的研究具有重要意義。本研究采集了河北省某2個豬場發生腹瀉的仔豬小腸內容物，經過病毒分離、鑒定和培養，獲得2株PDCoV，分別命名為PDCoV CHN-HeB-A1株和CHN-HeB-B2株，對其體外增殖能力、全基因組測序和遺傳進化進行了分析，以期為后續疫苗的研發和診斷試劑的研制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病料、細胞及主要試劑

病料為河北省某2個豬場發生腹瀉仔豬的小腸內容物，其中有3份樣品采自A豬場，2份樣品采自B豬場。腎小管上皮細胞LLC-PK1由筆者所在實驗室保存。抗PDCoV M蛋白單克隆抗體為筆者所在實驗室自制保存。FITC標記的羊抗鼠IgG購自上海碧云天生物技術有限公司。RNA反轉錄試劑、限制性內切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、高保真DNA聚合酶、DNA Marker、pGEM-T Easy克隆載體等購自大連寶生物公司。Trizol總RNA提取試劑盒為Omega公司產品。

1.2 病料處理

采集的小腸內容物中加入3～5倍體積的MEM培養液、青霉素200 U/mL和鏈霉素200 μg/mL，經攪拌混勻，在-20 ℃凍融3次，于4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，收集上清，-80 ℃保存備用。

1.3 RNA提取與RT-PCR分析

根據PDCoV CHN-HN-2014株(GenBank登錄號：KT336560)、PEDV AJ1102株(GenBank登錄號：JX188454)、TGEV WH-1株(GenBank登錄號：HQ462571)全基因組序列，設計特異性引物分別檢測PDCoV M基因、PEDV N基因和TGEV N基因(表1)。提取處理后的病料總RNA，經反轉錄獲得cDNA，以cDNA為模板，利用各引物對進行PCR擴增，產物經DNA試劑盒回收，克隆至pGEM-T Easy載體中進行測序鑒定。

表1 PEDV、PDCoV和TGEV檢測引物序列 Table 1 Primer sequences for detection of PEDV,PDCoV and TGEV

1.4 病毒的分離

取2 mL上述RT-PCR檢測為PDCoV陽性的樣品懸液，用0.22 μm濾器過濾除菌后，接種至長滿單層的LLC-PK1細胞，在37 ℃ 5% CO2的條件下吸附2～3 h后，棄去培養基，加入10 mL維持液(含7.5 μg/mL胰酶的MEM培養液)，于37 ℃ 5% CO2培養箱中培養2～3 d后收毒，若未觀察到細胞病變，則于-20 ℃凍融2～3次后再接種LLC-PK1細胞進行盲傳，并對收集的每代病毒液進行RT-PCR檢測，若傳到第5代(F5)仍無細胞病變則棄掉。

1.5 病毒的鑒定

1)間接免疫熒光分析。將PDCoV接種24孔細胞培養板中的LLC-PK1細胞，同時，設立不接毒對照組。待細胞出現病變后，PBS洗滌3次，室溫下4%多聚甲醛固定15 min；再用預冷的甲醇透化10 min，PBS洗滌3次，5%牛血清封閉45 min，PDCoV M單克隆抗體37 ℃孵育1 h。PBS洗滌3次，加入FITC標記的山羊抗鼠IgG，37 ℃孵育45 min，PBS洗滌3次，加入1∶2 000稀釋的DAPI(4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)進行核染色15 min，PBS洗3次，通過熒光顯微鏡觀察并拍照。

2)Western blot分析。將PDCoV感染LLC-PK1細胞，待細胞出現明顯的病變后收集細胞樣品，同時設立不接毒細胞對照組。將細胞樣品進行SDS-PAGE電泳分析，將凝膠中的蛋白轉印至硝酸纖維素膜上，經過10%的脫脂奶粉封閉2 h、PDCoV M單克隆抗體室溫孵育2 h、HRP標記的山羊抗鼠IgG室溫作用1 h，最后，通過BIO-RAD化學發光成像儀進行顯色分析。

3)PDCoV病毒粒子的超離純化與電鏡觀察。病毒液經過離心和0.45 μm濾器過濾去除細胞碎片，加入終濃度為0.5 mol/L的NaCl和質量分數為5%的PEG6000，充分混勻后置于4 ℃沉淀24 h，8 000 r/min離心1.5 h，棄去上清，沉淀中加入少量Tris-EDTA-氯化鈉緩沖液(TEN/STE)，于4 ℃溶解過夜；上述溶液經30%、45%和60%梯度蔗糖溶液離心，在30%～45%分層處和45%～60%分層處分別取樣；30 000 r/min離心4 h棄去上清去除蔗糖，在沉淀中加入少量STE于4 ℃溶解過夜。將獲得的病毒懸液樣品分別滴到銅網上吸附5 min，用濾紙輕輕吸取病毒懸液，待干燥后滴加20 g/L的磷鎢酸進行負染1 min，棄掉磷鎢酸，待干燥后在日立H-7000FA電子顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 病毒的TCID50測定

將病毒用含7.5 μg/mL胰酶的MEM培養液在1.5 mL EP管中作10倍系列稀釋，將每個稀釋度的病毒液接種到單層LLC-PK1的96孔細胞培養板中，每個稀釋度接種8孔，每孔接種100 μL。同時，設立MEM培養液作陰性對照。將96孔細胞培養板置于37 ℃ 5% CO2培養箱中培養，12 h后開始觀察，記錄細胞產生CPE孔數，直至細胞病變穩定。以上實驗重復3次，按Reed-Muench法計算病毒的TCID50。

1.7 PDCoV全基因組序列測定與分析

參照文獻[20]和PDCoV全基因組序列，設計16對擴增引物將PDCoV全基因組序列分為16個1 500～1 900 bp的基因片段進行擴增，所用引物序列見表2。將各片段克隆至pGEM-T Easy載體中，并送至武漢擎科生物公司測序。使用SeqMan軟件將16個基因片段序列拼接為完整的PDCoV全基因組序列。使用MegAlign軟件對PDCoV全基因組序列進行分析，利用MEGA 7.0軟件對全基因組序列進行遺傳進化分析。

2 結果與分析

2.1 病料的RT-PCR檢測

利用合成的特異性引物(表2)通過RT-PCR對臨床上常見的3種豬腸道冠狀病毒(PEDV、 TGEV和PDCoV)進行檢測，核酸凝膠電泳分析結果顯示5份樣品經RT-PCR分析均獲得大小約437 bp的PDCoV M基因特異性條帶，而對PEDV和TGEV檢測均為陰性(圖1)，說明腹瀉樣品為PDCoV陽性。

表2 PDCoV全基因組引物序列 Table 2 Primer sequences used to generate the full-length genome of PDCoV

M:代表DNA Marker; 1～7:RT-PCR檢測PEDV; 8～14:RT-PCR檢測TGEV; 15-21:RT-PCR檢測PDCoV; 3-7、10-14、17-21:代表5份腹瀉樣品; 1、8、15:陽性對照; 2、9、16:陰性對照; M:DNA Marker; 1-7:Detection of PEDV by RT-PCR； 8-14:Detection of TGEV by RT-PCR; 15-21:Detection of PDCoV by RT-PCR； 3-7,10-14,17-21：Five diarrhea samples; 1,8,15:Positive control; 2,9,16:Negative control.

2.2 PDCoV的分離

將處理好的5份PDCoV陽性樣品接種長滿單層的LLC-PK1細胞，發現接種后第3天有2份樣品(分別來源于2個豬場)接種的細胞產生病變，主要表現為細胞變圓、聚集、裂解、脫落，與PDCoV所致的病變一致，收集細胞培養物。將此2份細胞培養物在LLC-PK1細胞上傳至F5，結果每代都能穩定地引起細胞病變。提取每代病毒的RNA，通過RT-PCR方法擴增PDCoV的M基因，結果均能獲得大小約437 bp的特異性條帶(圖2)。說明所獲得的2株病毒均能在細胞上穩定傳代，分別命名為CHN-HeB-A1和CHN-HeB-B2株。

M:代表DNA Marker; 1:陽性對照; 2:陰性對照; 3-7:第1代至第5代CHN-HeB-A1株; 8-12:第1代至第5代CHN-HeB-B2株。M:DNA 2000 Marker; 1:Positive control; 2:Negative control；3-7:CHN-HeB-A1 strain from F1 to F5; 8-12:CHN-HeB-B2 strain from F1 to F5.

2.3 PDCoV分離株的鑒定

將PDCoV CHN-HeB-A1和CHN-HeB-B2株分別接種于24孔板培養的LLC-PK1細胞，待細胞出現病變時，收獲細胞樣品進行IFA和Western blot分析。IFA結果顯示2株病毒感染的細胞均可觀察到特異性綠色熒光，而對照組沒有綠色熒光(圖3A)；Western blot結果表明PDCoV M單克隆抗體特異性識別病毒表達的M蛋白條帶(圖3B)。進一步通過超離純化和電鏡觀察，結果顯示采集30%、45%蔗糖分層處的樣品可以觀察到病毒粒子，病毒粒子成球型，直徑100～150 nm，表面有囊膜和纖突，完整的病毒粒子呈典型的皇冠狀(圖3C)。這些結果證實這2株病毒均為PDCoV。

2.4 PDCoV感染細胞的動力學分析

為了分析2株病毒在LLC-PK1細胞上的增殖情況，將PDCoV CHN-HeB-A1株和CHN-HeB-B2株分別以感染復數(multiplicity of infection,MOI)為0.1的劑量接種LLC-PK1細胞，于接種后6、12、18和24 h收取培養物，進行間接免疫熒光實驗，結果如圖4A所示，PDCoV CHN-HeB-A1株和CHN-HeB-B2株感染細胞6 h時均可觀察到少量的特異性綠色熒光，隨著感染時間的延長，含有綠色熒光的細胞逐漸增多，24 h后由于細胞出現脫落，綠色熒光數量減少，整個實驗中對照組細胞均無特異性綠色熒光。

同時，將2株病毒分別以相同劑量(0.1 MOI)接種LLC-PK1細胞，于接種后4、8、12、16、20、24 h分別收取細胞培養物進行TCID50檢測，繪制病毒的一步生長曲線。結果如圖4B所示，感染后4 h，即可檢測到較低滴度的病毒，隨著感染時間的延長，病毒滴度也逐漸升高。在感染24 h后，兩分離株具有相當的病毒滴度。這些結果表明2株PDCoV具有相似的體外增殖曲線。

2.5 PDCoV全基因組測序與序列分析

提取病毒RNA，反轉錄成cDNA，以cDNA為模板，利用16對引物進行PCR擴增，結果顯示分別擴增出覆蓋PDCoV CHN-HeB-A1(圖5A)和CHN-HeB-B2株(圖5B)全基因組的16個片段，與預期片段大小相符。將各片段克隆至pGEM-T Easy克隆載體，送至武漢擎科生物技術有限公司測序，利用SeqMan軟件對所獲得的序列進行拼接，最終獲得2株PDCoV的全基因組序列。由于2毒株核苷酸相似性極高，達99.95%，提交了其中1個毒株(CHN-HeB-A1)全基因序列至GenBank，核酸序列號為MG242062。

A:IFA檢測PDCoV; B:Western blot檢測PDCoV; C:電鏡觀察PDCoV。 A:PDCoV detection via IFA; B:PDCoV detection via Western blot; C:PDCoV detection via electron micrograph.

A:IFA檢測PDCoV感染; B:PDCoV在LLC-PK1細胞上的一步生長曲線。 A:Detection of PDCoV infection via IFA; B:One-step growth curve of PDCoV in LLC-PK1 cells.

M:代表DNA Marker; A:擴增的PDCoV CHN-HeB-A1株16個基因片段; B:擴增的PDCoV CHN-HeB-B2株16個基因片段。M:DNA 2000 Marker; A:16 gene fragments amplified from PDCoV CHN-HeB-A1 strain; B:16 gene fragments amplified from PDCoV CHN-HeB-B2 strain.

利用MegAlign軟件對已報道的28株代表性毒株全基因組進行序列分析，結果顯示所有毒株相似性在97.0～99.9%，且PDCoV CHN-HeB-A1株和CHN-HeB-B2株序列與國內部分地區報道的毒株序列相似性相對較高，為98.7%～99.1%；與美日韓毒株的相似性為98.3%～98.8%，與東南亞毒株相距最遠，相似性為97.4%～97.7%(表3)。利用MEGA 7.0軟件對PDCoV CHN-HeB-A1和CHN-HeB-B2株與其他GenBank已發表的102株PDCoV全基因組序列進行全基因組的遺傳進化分析，并利用ITOL網站(http://itol.embl.de/)對樹形圖進行美化，結果顯示中國大陸毒株(包括分離的CHN-HeB-A1株和CHN-HeB-B2株)與中國香港毒株處于同一簇；美國、韓國、日本毒株處于一簇；東南亞毒株單獨成簇(圖6)。

圖6 PDCoV全基因組序列的系統發育樹分析Fig.6 Phylogenetic tree analysis of the genomic sequences of PDCoVs

3 討 論

由于PDCoV在LLC-PK1細胞上增殖的病毒滴度要高于在ST細胞上的增殖滴度，本研究選用了LLC-PK1細胞進行病毒的分離和培養，成功分離獲得了2株可以穩定傳代的PDCoV，并進一步通過IFA、Western blot分析和電鏡觀察得到全面鑒定。為了獲得增殖滴度高的病毒，對PDCoV CHN-HeB-A1與PDCoV CHN-HeB-B2株進行了克隆純化。同時為了盡量減少病毒的傳代次數，選擇了F3代病毒用于空斑純化，經過3輪空斑純化，獲得了病毒滴度較高(108.0TCID50/mL以上)的F6代病毒，用于后續研究。已有研究報道PDCoV分離株主要分為3個大的分支，包括東南亞(泰國、老撾、越南)毒株、中國毒株、美日韓(美國、日本、韓國)毒株[21-22]。本研究中PDCoV分離株CHN-HeB-A1與CHN-HeB-B2屬于中國毒株這一分支，全基因組進化分析表明這2個毒株與中國香港毒株處于同一簇。我們也對S基因序列進行了進化樹分析，結果與全基因組進化樹基本一致。

通過IFA和Western blot分析表明本研究分離到的2株PDCoV與筆者所在實驗室前期利用PDCoV CHN-HN-2014株M蛋白制備的單克隆抗體有很好的免疫反應，其致病性和免疫原性有待進一步研究。