甘蔗中次生代謝產物和保護酶與螟蟲抗性的相關性研究

王 輝，阿迪拉·阿迪力，楊乃博，熊 焰，伍蘇然*

(1中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所，海南海口571001；2北京農學院，北京100096)

0 引言

甘蔗(學名：Saccharum officinarum英文名：Sugarcane)是重要糖料作物，在我國廣西、云南、廣東、海南、福建、臺灣等地區廣泛種植。由于甘蔗種植面積大，宿根蔗可多年種植，從而導致蟲害嚴重，而為害甘蔗最嚴重的是甘蔗螟蟲。甘蔗螟蟲主要包括條螟、大螟、二點螟、紅尾白螟和黃螟，在我國各蔗區均有發生，在甘蔗的整個生長階段都嚴重危害甘蔗。受螟蟲危害后的甘蔗平均產量損失10%～25%[1]，其糖分降低0.93%～3.5%[2]。

螟蟲害防治方法有化學防治、生物防治和綜合防治法等[3]。化學防治多選擇使用殺蟲劑，對人體和環境都有毒害，生物防治和綜合防治法雖然安全環保，但是防治效果比較緩慢。近年來，我國甘蔗螟蟲普遍發生并造成嚴重危害，使防治甘蔗螟蟲為害已成為當前甘蔗生產上的一項重要工作。利用品種對害蟲的不敏感性，對害蟲種群實施控制，不但有利于害蟲的防治，也有利于減少環境污染、維持生態系統的平衡。利用甘蔗自身抗蟲特性選育抗蟲品種的甘蔗，是目前公認最根本、經濟效率高和對環境影響最少的辦法[4]。目前育種工作者已選育了許多甘蔗抗蟲品種，對螟蟲有不同程度的抵御能力，但是其抗蟲機理尚未被闡明。

植物被昆蟲取食后，植物體內可產生一些次生代謝產物，這些化合物對昆蟲有毒或者可避免昆蟲取食，以降低昆蟲對植物的危害[5]。同時，當植物受到蟲害脅迫后也會激活各種保護酶或防御酶，如超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)、過氧化物酶(Peroxisome，POD)、多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase，PPO)等，從而生成防御物質，直接毒殺害蟲，驅避害蟲或招引其天敵，對植物進行相應的保護[6]。茉莉酸類化合物(Jasmonates)是一種植物內源生長激素，用于調節植物生長發育、代謝途徑和抵御害蟲入侵[7]。研究表明：利用外源茉莉酸類化合物同樣可以誘導植物產生防御反應，與抵御病原微生物或蟲害入侵產生同樣的效果[8]。

本研究利用茉莉酸甲酯對苗期不同品種甘蔗進行處理，比較螟蟲抗性/易感甘蔗品種體內保護酶和次生代謝產物的差異，旨在為甘蔗的抗蟲品種選育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗前期對海南蔗區不同甘蔗種質對螟蟲抗性差異進行了比較，發現粵甘34號、云蔗03-258和粵甘26號具有很好的螟蟲抗性，而德蔗03-83號、粵甘 35號和柳城 03-1137則屬于螟蟲易感品種，ROC22號對螟蟲的抗性居中[9]。因此，本實驗采用的甘蔗品種為螟蟲抗性品種粵甘34號、云蔗03-258和粵甘 26號；螟蟲易感品種德蔗 03-83、粵甘 35號和柳城03-1137；對螟蟲的抗性介于抗性品種和易感品種之間的ROC22號，該品種目前在海南大規模種植。

1.2 實驗方法

將選取的甘蔗品種于2014年1月在中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所溫室內進行盆栽，生長1個月后，即2月份甘蔗長出5片葉子時，進行茉莉酸甲酯處理。

茉莉酸甲酯處理：用可調式噴霧器均勻的將配制好的茉莉酸甲酯噴施在植株葉片上，有水珠掛在葉片上是最宜的噴施程度。在用完茉莉酸甲酯處理72 h后，測定各樣品的總酚、單寧的含量以及過氧化氫酶、過氧化物酶和超氧化物歧化酶的酶活性。分別把每個品種重復3次。

1.2.1 總酚含量的測定

(1)樣品的提取：稱取甘蔗心葉以下第一片葉0.5 g，加入95%乙醇后將其研磨成勻漿，然后用濃度為95%的乙醇提取3次，轉入離心管中，以10000 r/ min的速度離心10 min，取上清液后定容至10 mL待測。

(2)總酚的測定[10]：將樣品溶液稀釋至100倍后取2 mL加入至試管，加入l mL Folin-Ciocalteu試劑，搖3 min搖勻后，加入2 mL 10%的Na2CO3溶液，靜置1 h后，用紫外分光光度計測定在670 nm處的OD值。用鄰苯二酚配置標準液，制作標準曲線。

1.2.2 單寧含量的測定

(1)樣品的提取：稱取1 g葉片，在冰浴中加蒸餾水研磨成勻漿，連同殘渣轉入離心管中，用蒸餾水提取3次后以1000 r/min的速度離心10 min，取上清液定容至10 mL，在20℃條件下保存備用。

(2)單寧的測定：取1 mL待測液，加入50 μL福林酚顯色劑和 10% Na2CO3溶液 4 mL，靜置 30 min，用紫外分光光度計測定在760 nm處的OD值。

1.2.3 過氧化氫酶(CAT)活力的測定

(1)酶液的提取：稱取甘蔗新鮮葉片0.5 g，置研缽中，加少量石英砂，在4℃下預冷的pH 7.8磷酸緩沖液3 mL后研磨成勻漿，把研缽用緩沖液沖洗3次，定容至25 mL。混合均勻后將溶液移入5℃冰箱中靜置l0 min。吸取上清液在離心機中以4000 r/min的速度離心15 min，再次吸取上清液，得酶液，保存于4℃條件下備用。

(2)酶活力的測定：用10 mL試管取一定量的酶，在25℃條件下預熱后，加入0.3 mL 0.l mol/L的H2O2后立即計時，在紫外分光光度計240 nm下測定吸光度，每隔1 min讀數1次，計算酶活性。

1.2.4 多酚氧化酶(PPO)活力的測定

(1)酶液的制備：準確稱取新鮮葉片 1 g，剪碎后放入研缽，加入配制好的提取液(0.1 mol/L的pH 7.0的磷酸緩沖液內含7% PVP和10% TritonX100)20 mL，與少量石英砂在冰浴條件下研磨成勻漿，再加入10 mL提取液，轉入離心管，于4℃左右8000 r/min離心5 min，取上清，得酶液，待測。

(2)酶活力的測定：取1 mL酶液，加入上述提取液2 mL，再加入苯二酚1 mL，混勻后立即用紫外分光光度計在405 nm處測定其吸光度，1 min后測第2次，記錄2次差值，以每分鐘變化0.01為1個酶活力單位，對測定結果進行計算。

1.2.5 過氧化物酶(POD)活力的測定

(1)酶液的提取：準確稱量采集的甘蔗新鮮葉片0.l g，放入研缽中，加適量 0.2 mol/L的 pH 6.0 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，研磨成勻漿。將勻漿移入離心管，用適量磷酸緩沖液沖洗研缽，在低溫條件下以4000 r/min的速度離心15 min。取上清液，定容至10 mL。低溫下貯存備用。

(2)酶活力的測定：過氧化物酶活力采用愈創木酚法。量取50 mL上述磷酸緩沖液于燒杯中，加入愈創木酚28 μL，放在磁力攪拌器上攪拌，待愈創木酚完全溶解后加入19 μL30% H2O2，均勻混合。加入1 mL待測酶液于3 mL上述混合液中，迅速混勻后，倒入比色皿用分光光度計于470 nm處測定吸光度，每分鐘測定1次，過氧化物酶活性單位(U)以每分鐘測定值變化0.01作為1個表示，計算其酶活力。

1.2.6 超氧化物歧化酶(SOD)活力的測定

(1)酶液的提取：準確稱取 0.5 g新鮮葉片，將其剪碎，加入4 m150 mmol/L pH 7.8的磷酸緩沖液和5 mLPVPP，冰浴研磨成勻漿后加入4 mL PBS溶液漂洗，轉入離心管，10000 r/min離心20 min，取上清液，棄殘渣，定容至10 mL，得待測酶液。

(2)酶活力的測定：取試管若干支，2支試管為對照，按表1加樣，加樣時盡量避光。加樣后混勻，將一支對照試管置于暗處避光，作為校零對照管，其它試管在光照下反應20 min后在560 nm處測吸光度，對酶活性進行計算。

表1 測定SOD的反應體系

2 結果與討論

2.1 茉莉酸甲酯誘導后甘蔗品種總酚和單寧含量的比較

茉莉酸甲酯誘導后甘蔗品種總酚含量如圖1所示，抗螟蟲甘蔗品種粵甘34號、云蔗03-258、粵甘26號的總酚含量無顯著差異，但均顯著高于ROC22號和易感螟蟲品種德蔗 03-83、粵甘 35號、柳城03-1137。易感螟蟲品種德蔗03-83、粵甘35號、柳城03-1137的總酚含量無顯著差異。ROC22號的總酚含量位于感、抗螟蟲品種之間，且與其它品種總酚含量差異顯著。可見甘蔗受到脅迫后的總酚含量與甘蔗品種的螟蟲抗性有關，螟蟲抗性越強，總酚含量越高。經茉莉酸甲酯處理后粵甘 34號和云蔗03-258的單寧含量顯著高于其他甘蔗品種，粵甘26號與 ROC22號差異不顯著，顯著高于易感螟蟲品種，ROC22號與德蔗03-83差異不顯著，顯著高于粵甘35號和柳城03-1137，如圖2所示。經茉莉酸甲酯處理后甘蔗品種間差異性顯著，抗螟蟲甘蔗品種的單寧含量均比易感螟蟲品種的單寧含量高。

圖1 茉莉酸甲酯誘導后甘蔗品種總酚含量的比較

圖2 甘蔗品種單寧含量的比較

植物中的許多次生代謝產物往往可以毒殺昆蟲或者具有昆蟲拒食活性，從而對植物自身起到保護作用，被昆蟲取食后其次生代謝產物含量的高低也直接反應了其抗蟲性的高低。如不同苜蓿品種在豌豆蚜為害后，抗蟲品種的總酚含量始終高于低抗品種和感蟲品種[11]。棉花被尺蠖取食后，其體內單寧、棉酚、槲皮素、蘆丁和氯原酸含量顯著增加[12]。本研究所選甘蔗品種在茉莉酸甲酯誘導后螟蟲抗性品種中總酚和單寧的含量明顯高于螟蟲易感品種，可見其抗蟲性和其在蟲害脅迫下次生代謝產物的生成有關。

2.2 茉莉酸甲酯誘導后甘蔗品種中CAT活性的比較

經茉莉酸甲酯誘導后的7個甘蔗品種CAT活力由高到低分別為粵甘34號、云蔗03-258、粵甘26號、ROC22號、德蔗 03-83、粵甘 35號和柳城03-1137，如圖3所示，且各個甘蔗品種間 CAT活力均有顯著差異。螟蟲抗性甘蔗品種的CAT活性顯著高于螟蟲易感品種。

圖3 茉莉酸甲酯誘導CAT活性的比較

CAT能催化H2O2分解為H2O和O2，降低多余的活性氧對細胞的損害，是植物為防御外界不良環境而產生的保護酶。綠豆受到豆蚜脅迫后，抗、易感品種CAT活性分別上升236.515%和124.426%，存在極顯著差異[13]。不同苜蓿品種受到豌豆蚜脅迫后，其高抗品種的CAT 活性始終高于低抗品種和易感品種[11]。研究結果表明：CAT活性與甘蔗的抗螟蟲活性呈正相關性，結果與文獻報道相符。

2.3 茉莉酸甲酯誘導后甘蔗品種中PPO活性的比較

茉莉酸甲酯誘導后各甘蔗品種PPO含量如圖4所示，甘蔗品種間PPO活性差異與感、抗螟蟲害的嚴重程度基本一致，PPO活性越高，抗螟蟲性越強。抗螟蟲品種粵甘34號、云蔗03-258、粵甘26號的PPO活性顯著高于 ROC22號以及易感螟蟲品種德蔗 03-83、粵甘 35號、柳城 03-113；ROC22號的PPO活性顯著高于易感螟蟲品種。

圖4 茉莉酸甲酯誘導PPO活性的比較

PPO是與植物抗蟲性物質關系密切的酶類物質，可催化酚類物質氧化為醌，并將一些必需氨基酸烷基化，從而使醌類物質抑制蟲害的消化系統，使其營養失衡。害蟲抗性作物在蟲害脅迫后，其PPO活性的提高文獻多有報道，如抗煙粉虱的黃瓜品種在人工接種煙粉虱后，其 PPO的活性明顯高于對照[14]；綠豆受到豆蚜脅迫后，豆蚜抗性品種PPO提高了359.674%，而易感品種的PPO活性僅僅提高了67.445%[13]。本研究結果也證實了在茉莉酸甲酯脅迫下抗螟蟲品種的甘蔗PPO活性顯著高于易感螟蟲品種，可見PPO活性可以為抗蟲品種選育作參考。

2.4 茉莉酸甲酯誘導后甘蔗品種中POD活性的比較

茉莉酸甲酯誘導后POD含量如圖5所示，甘蔗品種間POD活性差異顯著。粵甘34號的POD活性顯著高于其它品種材料，POD活性由高到低依次為云蔗03-258、粵甘26號、ROC22號、德蔗03-83、粵甘35號和柳城03-1137；抗螟蟲性品種的POD活性均顯著高于易感螟蟲品種。

圖5 茉莉酸甲酯誘導POD活性的比較

POD參與植物體內木質素的合成，其活性的增強可使得植物體內木質素積累，從而防止昆蟲取食[15]已有文獻報道，圣女果受到B型煙粉虱脅迫后，抗蟲品種體內的 POD活性的升高明顯高于感蟲品種[16]，這與實驗結果一致，說明POD活性是植物抗蟲性的標志之一。

2.5 茉莉酸甲酯誘導后甘蔗品種中SOD的活性比較

茉莉酸甲酯誘導后的7個甘蔗品種材料SOD活性(見圖6)，粵甘34號的SOD活性顯著高于其他品種材料，其次是云蔗03-258和粵甘26號；ROC22號位于感、抗品種材料之間。抗螟蟲品種的SOD活性均高于易感螟蟲品種德蔗03-83、粵甘35號、柳城03-1137。

圖6 茉莉酸甲酯誘導后不同甘蔗品種SOD活性的測定

SOD可將植物體內的活性氧歧化，產生過氧化氫和氧氣，為其它保護酶參與活性氧代謝提供底物，是活性氧代謝的第一步反應[17]。所以SOD活性的提高對植物應對逆境脅迫(包括蟲害)有重要作用。如北抗楊受蟲害后，其木質部的SOD活性高于未受蟲害的木質部[18]。馬鈴薯受到馬鈴薯塊莖蛾取食后，其葉片中SOD活性高于未受取食的葉片[19]。本研究中抗螟蟲甘蔗品種的 SOD活性均高于易感螟蟲品種，表明SOD活性可以作為螟蟲抗性選育的指標。

3 結論

經外源茉莉酸甲酯誘導后，抗螟蟲品種粵甘34號、云蔗03-258、粵甘26號的總酚和單寧含量以及幾種保護酶過氧化氫酶、多酚氧化酶、過氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性均高于螟蟲易感品種粵甘35號、德蔗03-83和柳城03-1137。茉莉酸甲酯誘導后甘蔗中次生代謝產物含量與保護酶活性均與甘蔗螟蟲抗性呈正相關，因此，可以作為評判甘蔗品種抗蟲性的重要指標。