益血膏中芍藥苷含量測定方法的建立

劉慧星

江西省藥品檢查員中心，江西 南昌 330006

益血膏由白芍、黃芪、益母草、地黃等十幾味中藥組成，具有益精血，補肝腎的功效。用于氣虛血虧引起的面色萎黃，精神倦怠，頭暈目眩，婦女血虛，月經不調，血小板減少，血紅蛋白降低［1］。本品中白芍處方量較大，具有養血調經、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽的功效［2］。其主要成分芍藥苷可通過PI3K/AKT/GSK-3β 信號通路進一步抑制大鼠系膜細胞增殖和炎癥反應并對系膜增殖性腎小球腎炎具有一定的治療作用［3］，有研究表明白芍總苷可通過抑制炎性因子水平，下調Wnt 和β-catenin mRNA 蛋白的表達，進一步抑制Wnt/β-catenin 信號通路和mTOR/HIF-1α 信號通路，從而減少類風濕性關節炎引起的關節破壞并降低滑膜細胞損傷程度而發揮抗炎作用［4-5］。本品收載于部頒標準（WS3-B-1219-92），該標準中只有性狀、鑒別和檢查項，未建立含量測定標準，標準偏低難以控制產品質量，因此，本研究旨在建立該品種的HPLC含量測定方法，為完善其質量標準提供參考［6-9］。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（四元泵、自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器）；SK5200 型超聲清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）；分析天平AL104（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2 試藥

益血膏（江西濟民可信藥業有限公司），芍藥苷（中國藥品生物制品檢定所批號：110736-201337，含量以94.9%計），乙腈為色譜級，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果［10-12］

2.1 色譜條件

色譜柱Agilent TC-C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：以乙腈-0.1%磷酸（14∶86）為流動相；流速1.0 mL/min；檢測波長為230 nm；理論板數按芍藥苷計算應不低于3 000。

2.2 對照品溶液及供試品溶液制備

供試品溶液制備：取益血膏約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，超聲至溶解，取出，放冷，再稱定重量，加50%甲醇補足減少的重量，濾過，取續濾液再用0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得。

對照品溶液制備：精密稱取芍藥苷對照品11.18 mg 置50 mL 量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取2 mL 至10 mL 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，再用0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得。

陰性樣品溶液制備：取無白芍藥材的益血膏陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗

分別精密吸取上述供試品溶液、對照品溶液和陰性樣品溶液各20 μL，注入HPLC 色譜儀，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。結果顯示芍藥苷理論塔板數均高于3 000；供試品色譜在與對照品色譜相應的位置上，芍藥苷色譜峰保留時間一致，陰性樣品溶液中的其他成分對測定無干擾，結果表明該測定方法專屬性較好。見圖1。

圖1 高效液相色譜圖：A.對照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性樣品；1.芍藥苷

2.4 線性關系考察

精密稱取芍藥苷對照品11.18 mg，置50 mL 量瓶中，加含50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得母液。精密吸取母液加50%甲醇制成含芍藥苷10.610、21.220、42.439、63.659、106.098 μg/mL的對照品溶液，注入液相色譜儀，按“2.1”色譜條件測定峰面積，以對照品濃度（μg/mL）為橫坐標（x），以峰面積積分值（A）為縱坐標（y），繪制標準曲線，得線性方程為y=0.397 91x+0.304 4，r=0.999 9，表明芍藥苷在10.610～106.098 μg/mL 范圍內線性關系良好。

2.5 精密度試驗

精密吸取對照品溶液20 μL，按“2.1”色譜條件進行測定，連續進樣6 次，測定峰面積，結果RSD（n=6）為0.4%，表明該方法精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取同一供試品溶液,分別于制備后0、2、4、8、12、24 h 注入液相，記錄峰面積,結果RSD（n=6）為0.4%。表明供試品溶液在24 h 內穩定。

2.7 重復性試驗

取供試品1 g，按照“2.2”項下制備供試品溶液，平行6 份，結果芍藥苷平均含量為1.91 mg/g，RSD（n=6）為1.5%。表明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收試驗

取已知含量（批號 191001；含量以1.86 mg/g 計）約0.5 g，平行6 份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密吸取芍藥苷對照品溶液（濃度：0.085 mg/mL）10 mL，再精密加入50%甲醇40 mL。按照“2.1”項下的色譜條件進行分析，計算回收率。結果見表1。由表1 可知，平均回收率為100.5%，RSD 為1.8%，表明該方法準確度良好。

表1 回收率試驗（n=6）

2.9 含量測定

取10 批益血膏樣品，按照“2.1”項下進行測定，其結果在1.79～2.23 mg/g。見表2。

表2 含量測定結果（n=4）

3 討論

3.1 溶劑的選擇

芍藥苷是一種蒎烷型單帖類，可溶于甲醇，本研究分別考察了不同的提取溶劑（30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇），由于本品為煎膏劑，含有大量的蜂蜜，用70%甲醇為溶劑時樣品處理操作困難，故選擇50%甲醇為提取溶劑。

3.2 流動相的選擇

本研究分別考察了不同的流動相系統（乙腈-0.1%磷酸，乙腈-0.1%甲酸，乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀），結果表明后兩種流動相的色譜圖基線漂移較大，而采用乙腈-0.1%磷酸，基線無干擾且分離度較好。

3.3 波長的選擇

本研究對芍藥苷對照品進行紫外全波長掃描，結果在231.5 nm 處有最大吸收，參考《中國藥典》2020 版一部的白芍含量測定方法，故確定檢測波長為230 nm 。

4 結論

本品收載于部頒標準，該標準無含量測定項，難以有效控制產品質量，本研究建立了益血膏中芍藥苷的HPLC 含量測定方法，結果表明該方法靈敏，操作簡便，結果可靠，能更好地控制益血膏產品質量，也可為益血膏質量標準的提升提供幫助。