LC-MS/MS 法測定大活絡丸中血竭素的含量

易徐航，張鈺祺，楊恢檢

萍鄉市食品藥品檢驗所，萍鄉 江西 337000

大活絡丸是由血竭、麝香、牛黃、烏梢蛇、蘄蛇、兩頭尖、防風、羌活、全蝎等48 味藥材研成細粉，混合均勻加煉蜜制成的丸劑。具有祛風止痛、舒筋活絡等功效，臨床上常用于中風痰厥引起的癱瘓，足痿痹痛，腰腿疼痛，跌打損傷，胸痹等癥狀［1］。大活絡丸中含有多味傳統的名貴中藥材，其中，血竭更是被譽為“活血療傷之良藥”。血竭作為處方中的臣藥，具有生肌斂瘡，活血定痛，化瘀止血之功效［2］，其主要活性成分為血竭素［3］。現代研究表明，血竭素具有活血與止血的雙向調節作用［4-7］。目前大活絡丸的執行標準多為衛生部藥品標準中藥成方制劑第六冊WS3-B-1082-92［8］，該標準已經執行多年，僅有簡單的丸劑通則檢查，并不能對其質量進行有效地控制。近年來，高效液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）在中成藥中有效成分的含量測定中應用日益廣泛［9-10］。本試驗采用LC-MS/MS 法測定大活絡丸中血竭素的含量，以期為控制和提高大活絡丸的質量提供科學依據。

1 材料

1.1 試藥

血竭素高氯酸鹽對照品（批號：110811-201707，含量：96.3%），購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇（HPLC 級，購于ThermoFisher 公司）；甲酸（HPLC 級，天津市科密歐化學試劑有限公司）；水為屈臣氏蒸餾水。樣品信息見表1。

表1 樣品信息

1.2 儀器

安捷倫6460 型高效液相色譜-三重四級桿質譜聯用儀；CP-225D 型電子天平（十萬分之一，SARTORIUS 公司）；ME-204 型電子天平（萬分之一，METTLER TOLEDO 公司）；KQ-500DB 型超聲儀（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

選擇Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；流動相為甲醇（A）-0.1% 甲酸（B），梯度洗脫（0～3 min，40% A；3～8 min，40% A →100% A；8～10 min，100% A；10～10.5 min，100% A →40% A；10.5～15 min，40% A）；流速0.2 mL/min；柱溫為35 ℃；進樣量10 μL。血竭素對照品和大活絡丸供試品的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 總離子流色譜圖：A.血竭素對照品；B.供試品

2.2 質譜條件

采用電噴霧離子源（ESI）正離子檢測，多反應監測（MRM）方式進行掃描。干燥氣和霧化器均為高純氮氣，毛細管電壓4 000 V；干燥氣溫度300 ℃；干燥氣流量8 L/min；霧化氣壓力30 psi。選擇質荷比（m/z）267.0 →222.9 作為定量離子對，m/z 267.0 →251.0、m/z 267.0 →196.9 作為定性離子對。傳輸電壓（Fragmentor）為135 V，碰撞能量（Collision Energy）為34 V。血竭素對照品和大活絡丸供試品的二級質譜見圖2。

圖2 二級質譜圖：C.血竭素對照品；D.供試品

2.3 溶液的配制

2.3.1 對照品儲備液的制備 精密稱取血竭素高氯酸鹽對照品10.66 mg，置100 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得含血竭素74.6 μg/mL的儲備溶液（血竭素重量=血竭素高氯酸鹽重量/1.377）［2］。

2.3.2 供試品溶液的制備 取樣品大蜜丸2 丸，剪碎，加入等量硅藻土，研勻，取約7 g（相當于1 丸量）置具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理（功率：500 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷至室溫，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，4 000 r/min 離心10 min，取上清液用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.3.3 陰性樣品溶液的制備 按工藝方法制備缺少血竭藥材的陰性樣品，按“2.3.2”項下方法操作，制成陰性樣品溶液，依法測定，結果顯示陰性樣品的總離子流色譜圖中，無呈現與血竭素對照品保留時間相同的色譜峰，見圖3。

圖3 陰性樣品總離子流圖

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 精密吸取上述血竭素對照品儲備液，加甲醇逐級稀釋得系列標準溶液，濃度分別為37.3、74.6、373.0、746.0、1 492.0、3 730.0 ng/mL。按“2.1”“2.2”項下的色譜和質譜條件進行測定，以血竭素對照品的進樣濃度（ng/mL）為橫坐標（X），相應的峰面積值為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得線性回歸方程：Y=328.53X+57 753，r=0.999 8。結果表明，血竭素的進樣濃度在37.3～3 730.0 ng/mL 呈良好線性關系。

2.4.2 精密度試驗 精密吸取血竭素對照品溶液（373.0 ng/mL）10 μL，按“2.1”“2.2”項下的色譜和質譜條件連續進樣6 針，測定峰面積。血竭素峰面積的RSD 為0.40%，表明儀器的精密度良好。

2.4.3 穩定性實驗 取同一份大活絡丸供試品溶液（編號S1），分別于制備后0、2、4、6、8、10、12、24 h 精密吸取10 μL 進樣，按“2.1”“2.2”項下的色譜和質譜條件，測定血竭素的峰面積，其RSD 為1.28%，結果表明大活絡丸供試品溶液在室溫下24 h 內穩定。

2.4.4 重復性試驗 取同一批號（編號S1）樣品六份，按“2.3.2”項下方法制備大活絡丸供試品溶液，按“2.1”“2.2”項下的色譜和質譜條件進樣測定，計算血竭素的含量（μg/g）。結果計算得血竭素含量的RSD 為1.02%，表明該方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 取已知含量（編號S1：3.97 μg/g）的大活絡丸樣品2 丸，剪碎，加入等量硅藻土，研勻，取約3.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入血竭素對照品溶液（3.73 μg/mL）適量，按“2.3.2”項下方法制備大活絡丸加樣回收溶液，按“2.1”“2.2”項下的色譜和質譜條件進樣測定含量，計算加樣回收率。結果表明血竭素的平均回收率為100.09%，RSD 為1.42%，結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果（n=6）

2.4.6 檢測限與定量限 取血竭素對照品溶液加甲醇逐級稀釋后進樣測定，以信噪比3∶1的對照品溶液濃度為檢測限（LOD），以信噪比10∶1的對照品溶液濃度為定量限（LOQ）。結果血竭素檢測限為1.33 ng/g；定量限為4.00 ng/g。

2.4.7 耐用性試驗 取同一批號（編號S1）樣品，按“2.3.2”項下方法制備大活絡丸供試品溶液，分別選擇Agilent Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；Waters XBridge BEH C18（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）；Welch Ultimate XB-C18（2.1 mm×100 mm，3 μm）3 種品牌的色譜柱，按“2.1”“2.2”項下的色譜和質譜條件測定，結果無明顯差別。

2.5 樣品測定

取不同廠家的10 批大活絡丸（編號S1-10），按“2.3.2”項下方法制備大活絡丸供試品溶液。分別精密吸取血竭素對照品溶液與大活絡丸供試品溶液各10 μL 注入液相色譜儀，測定，即得。結果見表3。

表3 大活絡丸樣品中血竭素含量測定結果（n=3）

3 討論

3.1 紫外與質譜檢測器的比較

本文曾采用高效液相紫外檢測器對大活絡丸中血竭素進行含量測定，由于大活絡丸處方龐大，成分復雜，通過優化流動相以及改進提取方式等方法，其樣品中的主峰分離效果均不理想，且血竭素在處方中的含量較低，紫外檢測器難以滿足分析要求。質譜檢測器具有專屬性強、靈敏度高等［11-12］優勢，故本試驗建立了LC-MS/MS 法測定大活絡丸中血竭素含量的方法。

3.2 流動相的選擇

在試驗中還考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.01 mol/L 醋酸銨溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.01 mol/L 醋酸銨溶液等多組流動相體系，結果表明，流動相為甲醇-0.1%甲酸時梯度洗脫能得到較好的峰型和分離度。

3.3 提取方法及時間的考察

本次收集的大活絡丸樣品均為大蜜丸，采用加入等量的硅藻土研勻的方式，以便于目標成分的溶出。提取條件采用超聲提取法分別考察了甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇四種提取溶劑，結果表明甲醇提取效率最高。在此基礎上，分別考察了超聲和回流2 種提取方式，結果顯示超聲與回流提取效率相當，故選用提取簡便的超聲提取方式。同時對甲醇溶液用量10、25、50 mL，以及超聲時間10 min、30 min、1 h 進行考察，最后確定采用甲醇超聲（500 W，40 kHz）處理30 min 為宜。

3.4 質譜條件的優化

在對質譜條件進行優化時，分別考察了毛細管電壓、干燥氣溫度、干燥氣流量和霧化氣壓力對含量測定的影響，最終確定毛細管電壓4 000 V，干燥氣溫度300 ℃，干燥氣流量8 L/min，霧化氣壓力30 psi 為最優狀態。采用ESI 電離模式，分別比較了血竭素在正離子掃描和負離子掃描模式下的響應信號，發現血竭素在正離子化模式下響應值較高。通過全掃模式（Full Scan），確定血竭素的母離子。通過選擇單離子檢測模式（SIM）和子離子檢測模式（Product Ion Scan）對傳輸電壓和碰撞能量等關鍵參數的優化，以確保定量檢測的準確性。

3.5 小結

從對10 批大活絡丸中血竭素的含量測定結果來看，血竭素的含量為0.29～7.15 μg/g。不同廠家生產的大活絡丸血竭素含量相差較大，提示血竭原藥材的質量或廠家的生產工藝存在差異。為避免由原藥材或生產工藝引起中成藥的療效差異，建議廠家進一步完善質控標準和生產工藝，確保產品質量的均一性和有效性。本文建立了LC-MS/MS 法測定大活絡丸中血竭素含量的方法，經方法學驗證，該方法結果準確、快速，重復性好，操作簡便，可用于大活絡丸中血竭素的含量測定。