復方鮮竹瀝液微生物限度檢查法的建立

張靜，張春華，周萍，章瑛，謝茵

江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，江西 南昌 330029

復方鮮竹瀝液為江西省特色中藥制劑，檢驗標準收載于《中華人民共和國藥典》（簡稱《中國藥典》）2020 年版一部［1］，標準對其微生物限度要求較為嚴格，需氧菌總數≤102cfu，霉菌和酵母菌總數≤10 cfu，并不得檢出大腸埃希菌。復方鮮竹瀝液處方包括鮮竹瀝、生半夏、魚腥草、枇杷葉、桔梗、生姜、薄荷素油等七味藥材，用于痰熱咳嗽，痰黃黏稠等。該制劑為合劑，含有豐富的維生素和水分，pH 在4.8～6.0 之間，處方中又加入蔗糖或甜菊素等微生物生長所需的物質，環境極易于微生物的生長和繁殖。制劑的微生物污染程度，對制劑的有效性、穩定性和安全性都產生重大的影響，也直接關系到臨床用藥的安全［2-4］。鑒于復方鮮竹瀝液的使用較廣，生產企業較多，有必要對其微生物污染狀況進行研究，建立適用于不同企業的微生物限度檢查方法，為復方鮮竹瀝液的用藥安全和質量控制提供參考。本研究選擇了江西省內6 家生產企業共計9 批次復方鮮竹瀝進行方法學考察及驗證。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

YXQ-LS-50S Ⅱ高壓蒸汽滅菌器（上海博迅實業醫療器械有限公司），Sartorius T601-L 電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司），SW-CJ-2D 凈化工作臺（蘇州凈化有限公司），PYX-DHS 細菌培養箱、MJ-160B 霉菌培養箱、PYX-DHS 隔水式恒溫培養箱（均為上海躍進醫療器械廠）。

1.2 培養基與菌種

胰酪大豆胨液體培養基（北京三藥科技開發有限公司，批號：20200324），胰酪大豆胨瓊脂培養基（北京陸橋技術股份有限公司，批號：191104），沙氏葡萄糖液體培養基（北京陸橋技術股份有限公司，批號：20200310），沙氏葡萄糖瓊脂培養基（北京陸橋技術股份有限公司，批號：20200310），麥康凱液體培養基（青島海博生物技術有限公司，批號：20190927），麥康凱瓊脂培養基（青島海博生物技術有限公司，批號：20191121），4-甲基傘形酮葡糖苷酸-蛋白胨培養基（青島海博生物技術有限公司，批號：20191124）。上述培養基進行適用性檢查，生長能力、抑制能力及指示特性均符合實驗要求。

菌種均來自中國食品藥品檢定研究院。使用菌種信息如下：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）［CMCC（B）63501］，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC（B）26003］，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC（B）10104］，白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC（F）98001］，黑曲霉（Aspergillus niger）［CMCC（F）98003］，大腸埃希菌（Escherichia coli）［CMCC（B）44102］。以下使用菌種均按《中國藥典》2020 年版要求稀釋制備，做活菌計數備用。

1.3 樣品

抽取江西省內6 家生產廠家，包括江西南昌濟生制藥有限責任公司3 批（規格：10 mL、20 mL，150 mL），江西遠東藥業股份有限公司1 批（規格：10 mL），江西濟民可信藥業有限公司2 批（規格：10 mL、20 mL），江西匯仁藥業股份有限公司1 批（規格：10 mL），江西天施康中藥股份有限公司1 批（規格：10 mL），江西九華藥業有限公司1 批（規格：10 mL），共計9 批次復方鮮竹瀝液。

2 實驗方法與結果

建立樣品的微生物限度檢查法時，首先需進行方法的驗證，以證明所采用的方法適合于該樣品的微生物限度檢查，也就是確認樣品在一定的檢驗量和一定的檢驗條件下無抗菌活性或抗菌活性在該條件下被消除到可以忽略不計，盡可能地去除或者中和抗菌活性，以保證本檢驗結果的準確可靠和檢驗方法的完整度。實驗參照《中國藥典》2020 年版四部通則1105（微生物計數法）、1106（控制菌檢查法）［7］進行試驗，以確定復方鮮竹瀝液的微生物限度檢查方案的完整建立［5-7］。

2.1 實驗方法

樣品包含混勻的樣品原液和1∶10 供試液。取樣品10 mL，置錐形瓶中，加90 mL pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液混勻，作為1∶10 供試液。

按如下公式計算加菌回收比值：

2.1.1 需氧菌總數計數法 試驗組：取混勻的樣品原液9.9 mL 和1∶10 供試液9.9 mL，分別加入適宜濃度的試驗菌液0.1 mL，混勻，使每1 mL 供試液中含菌量≤100 cfu。取1 mL 注入平皿，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養基，置30～35 ℃培養箱培養24 h～ 72 h，每隔24 h 觀察一次結果。供試品對照組：取上述制備好的原液和1∶10 供試液，以pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液，同試驗組操作，測定供試品本底菌數。菌液對照組：取相應pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液，按試驗組操作加入試驗菌液0.1 mL，混勻，后續操作同試驗組。

2.1.2 霉菌和酵母菌總數計數法 試驗組：取混勻的樣品原液9.9 mL，加入適宜濃度的試驗菌液0.1 mL，混勻，使每1 mL供試液中含菌量≤100 cfu。取1 mL注入平皿，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養基，置20～25 ℃培養箱培養24 h～120 h,每隔24 h 觀察一次結果。供試品對照組和菌液對照組參照“2.1.1”項下制備，培養基為沙氏葡萄糖瓊脂培養基，置20～25 ℃培養箱培養24 h～120 h，每隔24 h 觀察一次結果。

2.1.3 大腸埃希菌檢查法 試驗組：取1∶10 供試液10 mL 加入100 mL 胰酪大豆胨液體培養基中，同時加入＜100 cfu的大腸埃希菌液，置35 ℃培養18 h～24 h，取上述培養物1 mL 接種至100 mL 麥康凱液體培養基中，42 ℃培養24～48 h 后取麥康凱液體培養物劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，35 ℃培養18～72 h，取麥康凱瓊脂平板上菌落經純化后的培養物，接種至含5 mL 4-甲基傘形酮葡糖苷酸-蛋白胨培養基的試管內培養，分別于5 h、24 h 在366 nm 波段處紫外線下觀察，同時用未接種的4-甲基傘形酮葡糖苷酸-蛋白胨培養基作空白對照。觀察后，沿管壁加入數滴靛基質試液再觀察。陰性對照組：取pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 mL 照大腸埃希菌檢查法操作。

2.2 結果

根據《中國藥典》2020 年版四部通則1105（微生物計數法），需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數方法學驗證需三次獨立平行的實驗數據，結果判定為回收比值均在0.5～2 之間；控制菌檢查方法為能有所加菌落的典型特征反應來判定。

9 批次復方鮮竹瀝液經過驗證：需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數在三次獨立的平行試驗中各種菌落的回收比值均在0.8～1.3 之間，符合《中國藥典》2020 年版四部通則1105（微生物計數法）判定要求，見表1。大腸埃希菌檢查亦能見所加菌落的典型反應，見表2。

表1 平行試驗中菌落的回收比值

表2 大腸埃希菌檢查法方法學驗證試驗結果

6 家企業的9 批次樣品，經過試驗最后確定微生物限度檢查法略有不同。

其中8 批次樣品方法為：取樣品原液按平皿法（1 mL/皿），依法測定需氧菌總數；取樣品原液按平皿法（1 mL/皿），依法測定霉菌和酵母菌總數；取1∶10 供試液10 mL 至100 mL 胰酪大豆胨液體培養基，依法檢查大腸埃希菌。1 批次樣品方法為：取1∶10 供試液按平皿法（1 mL/皿），依法測定需氧菌總數；取樣品原液按平皿法（1 mL/皿），依法測定霉菌和酵母菌總數；取1∶10 供試液10 mL 至100 mL 胰酪大豆胨液體培養基，依法檢查大腸埃希菌。同一企業不同規格的樣品方法一致。結果見表3。

表3 微生物限度檢查方法

3 討論

復方鮮竹瀝液為中藥液體口服制劑，其本身并無抑菌性，容易受微生物污染而導致藥物變質，處方中通常加有一定量抑菌劑以保持制劑在保質期內不受微生物入侵?！吨袊幍洹?020 年版一部收載的復方鮮竹瀝液制法中明確指出1 000 mL的復方鮮竹瀝液中加入3 g 苯甲酸鈉，抑菌劑濃度為0.3%。經查閱企業的處方資料，6 家企業的復方鮮竹瀝液均加入一定量的抑菌劑苯甲酸鈉。復方鮮竹瀝液微生物限度檢查方法的略有不同有可能為企業制備時添加抑菌劑苯甲酸鈉的濃度不一致導致。

實驗結果表明不同生產企業的樣品，微生物限度檢查法略有差異，體現在需氧菌總數檢查方面，兩種方法分別樣品原液和1∶10 供試液。方法的差異與復方鮮竹瀝液處方中加入的抑菌劑濃度有關，與樣品的規格無關。