LED光質對食品用小麥芽苗生長和酚類物質累積的影響

(常建偉 楊潤強 王 沛 顧振新

(南京農業大學食品科學技術學院，南京 210095)

小麥(TriticumaestivumL.)為禾本科單子葉植物，是我國北方地區重要的糧食作物。小麥籽粒主要用于制粉并加工成面制品。由于小麥磨粉時剔除的胚芽和麩皮中富含蛋白質、脂肪和膳食纖維等營養素[1]，因而小麥籽粒全利用技術研發備受科技工作者的關注。小麥籽粒經發芽形成麥苗后可以進一步提高其營養與保健價值，以此為原料開發功能性食品，達到小麥籽粒及其芽苗全利用的目的。

植物籽粒萌發后，內源酶系被激活，大分子儲存性物質降解成更易為人體消化吸收的小分子物質[2]。同時，膳食纖維、葉綠素和維生素，以及酚類物質和葉酸等生物活性物質含量顯著增加[3]。研究表明，小麥芽苗有增強人體免疫力、抗氧化、抗疲勞、促進微循環和降低慢性疾病的風險等作用[4]。這些保健作用與其芽苗中獨特的酚類物質及其抗氧化特性密切相關[5]。植物酚類化合物主要通過苯丙烷類代謝途徑生物合成[6]。苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia lyase，PAL)、4-香豆酸-CoA連接酶(4-coumarate-CoA ligase，4CL)和肉桂酸4-羥化酶(Cinnamic acid 4-hydroxylase，C4H)是酚類化合物合成途徑中的關鍵酶[7, 8]。酚類物質的合成與積累與這些酶的基因表達密切相關。光照不僅為植物光合作用提供能量，而且還是植物體生長和發育過程中的重要調節因子[9]。種子在萌發和芽苗生長時對光等環境變化尤為敏感[10]。光可以促進植物體內酚酸等次級代謝產物的合成[9]。Liu等[11]發現藍光處理顯著增加豌豆幼苗中綠原酸、沒食子酸、咖啡酸、對香豆酸和阿魏酸含量。紫外光(UV-B)和藍光處理顯著增加蘿卜芽苗菜中酚類物質含量和抗氧化能力[12,13]。青錢柳葉在藍光和綠光處理后酚類含量及抗氧化活性提升[14]。藍光連續照射顯著提高大豆芽苗中黃酮類化合物的含量[15]。這些研究僅在光質對總酚含量和抗氧化能力的變化層面，鮮有涉及酚類物質合成相關酶活性及其基因表達在光質調控酚類物質積累中的作用機制。

本研究用LED光源的白光、紅光、藍光、綠光及黃光處理小麥芽苗，探討了不同光質下小麥芽苗生長狀況、總酚含量、酚酸組成及其抗氧化能力變化，研究了不同光質對小麥芽苗酚類合成關鍵酶PAL、C4H和4CL活力及其基因表達量的影響，以揭示光質調控酚類物質積累的作用機理，為開發富含酚類的食品用小麥芽苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥(品種：淮麥33號)；酚酸標品：香草酸、咖啡酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸和芥子酸均為分析純；DPPH(>97%)、ABTS(>98%)、Trolox(>97%)為分析純；甲醇、乙腈、乙酸為色譜純。

1.2 主要儀器設備

康麗CB-A321發芽機，LB-300-II光照培養箱，755B 型分光光度計，冷凍離心機，LC-20A型高效液相色譜儀(HPLC)。

1.3 實驗設計

小麥籽粒用去離子水沖洗干凈，置于1%(V/V)的次氯酸鈉水溶液浸泡消毒15 min，然后用去離子水漂洗至pH中性，洗凈的小麥籽粒在去離子水中于25 ℃浸泡6 h。籽粒浸泡后移入自動發芽機中，在溫度25 ℃、相對濕度85%條件下避光催芽2 d，剔除敗芽和死粒后，置于光照培養箱培養。設定白光(W，400～690 nm)、紅光(R，600～690 nm，峰值655 nm)、綠光(G，460～597 nm，峰值 520 nm)、藍光(B，400～500 nm，峰值 445 nm)和黃光(Y，560～650 nm，峰值 595 nm)5種光處理，光照強度為(30±2) μmol/(m2·s)，光周期為光照16 h和黑暗8 h交替進行，光照培養箱內相對濕度為85%，晝夜溫度均為25 ℃，以黑暗(D，不進行光照處理)為對照。芽苗生長期間，每小時噴淋1次去離子水，每次1 min，每24 h更換1次培養液。照光培養4 d后取樣。

1.4 測定指標與方法1.5 主要生理指標

芽長和根長：隨機選取30株小麥芽苗，用游標卡尺測定其芽長和根長，取其平均值，結果表示為cm/株。

鮮質量/干質量：隨機選取100株小麥芽苗，準確稱取其鮮質量，冷凍干燥后再稱取其質量，即為100株小麥芽苗的干質量，重復稱量3組，取其平均值。

葉綠素含量：在黑暗條件下，小麥芽苗中葉綠素經80%丙酮提取后，提取液分別在663 nm和645 nm下測定吸光值。

葉綠素a=12.72A663-2.59A645

葉綠素b=22.88A645-4.67A663

1.4.2 酚類化合物含量

采用Chen等[4]方法提取發芽小麥的游離酚和結合酚。總酚含量采用福林-酚法測定[16]，以沒食子酸配制標準曲線，總酚含量以 mg GAE/100 g DW 計。酚酸含量參考Wang等[17]的方法測定。樣品通過HPLC分析(島津LC-20A高效液相色譜)，配備C18 110A(5 μm粒徑，4.6×150 mm)，流動相A為0.1%的醋酸水溶液，流動相B為甲醇，柱溫35 ℃，波長280 nm。根據酚酸標品進行分析和定量，酚酸含量以 μg/g DW計。

1.4.3 自由基清除能力

ABTS+·清除能力和DPPH·清除能力：參照Chen等[18]和Ma等[16]方法。以Trolox作為標準品，分別在734 nm和515 nm波長下測定吸光值。自由基清除活性用 μmol TE(Trolox equivalents)/g DW表示。

1.4.4 酚類物質合成關鍵酶活力

PAL活力：參照Chen等[18]的方法，在290 nm下測定OD值。以每小時每克小麥芽苗(鮮質量)酶促反應體系吸光度增加0.01為1個PAL活性單位(U)，表示為0.01ΔOD290/h·g FW。

C4H活力：參照Yan等[19]的方法，在340 nm下測定OD值。以每分鐘每克小麥芽苗(鮮質量)酶促反應體系吸光度值增加0.01為1個C4H活性單位(U)，表示為0.01ΔOD340/min·g FW。

4CL活力：參照陳雷等[20]的方法，在333 nm下測定OD值。以每分鐘每克小麥芽苗(鮮質量)酶促反應體系吸光度值增加0.01為1個4CL活性單位(U)，表示為0.01 ΔOD333/min·g FW。

1.4.5 基因表達分析

PAL、C4H和4CL的引物參考Chen 等[18]的引物序列，如表1所示，由南京某公司合成。取10株液氮速凍后的小麥芽苗，按照RNA提取試劑盒的說明書提取總RNA。使用反轉錄試劑盒(Takara, RT-PCR Mater Mix Kit, Catalog No. RR036A)合成第一鏈cDNA。

表1 qRT-PCR分析引物序列

使用SYBR Premix Ex Taq (Takara, catalog no. RR420A)試劑盒和ABI 7500 Fast Real-Time PCR System進行實時熒光定量PCR分析，熒光定量PCR擴增程序為：第一步(預變性)，95 ℃，30 s；第二步(PCR反應)，95 ℃，30 s，再 60 ℃，30 s，循環40次。

1.5 數據統計與分析

實驗設3次生物學重復，數據以平均值±標準差表示。采用SAS 9.2軟件Duncan’s多重比較法進行顯著性分析，顯著性水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 小麥芽苗主要生理代謝

從圖1可以看出，與對照(D)相比，紅光和黃光提高了小麥芽苗芽長和鮮/干質量比，說明紅光和黃光增加芽苗含水量，促進其生長。紅光和黃光處理的小麥芽苗芽長分別是對照的1.26 倍和1.20倍(圖1c)。白光和藍光顯著減少了小麥芽苗的根長，其中白光處理下小麥芽苗根長最短，相較對照減少了9.25%，紅光、綠光和黃光對小麥根長無顯著影響。小麥芽苗中葉綠素a占總葉綠素含量的77.75%～87.90%(圖1b)。白光處理下總葉綠素含量最高，綠光處理下總葉綠素含量最低，較白光(W)下降34.47%，說明綠光不利于葉綠素的積累。圖1d顯示，紅光和黃光處理顯著提高了小麥芽苗的鮮/干質量比，分別為對照的1.11 倍和1.09 倍；白光、綠光和藍光對其則無顯著影響。

注：D：黑暗；W：白光；R：紅光；B：藍光；G：綠光；Y：黃光；下同。不同光質處理的前2 d為黑暗催芽，第3天開始照光處理4 d，光強為30 μmol/(m2·s)，光周期為白天16 h，黑暗8 h，取生長6 d的小麥芽苗供實驗研究；葉綠素測定時取籽粒上方綠色的莖葉部位作為材料進行葉綠素測定。同一顏色柱上小寫字母不同表示不同處理間存在顯著差異(P<0.05)，下同。

2.2 小麥芽苗總酚含量

由圖2可知，光照處理顯著增加了小麥芽苗中總酚含量，以黃光、綠光和藍光處理的小麥芽苗增加最多，較對照(D)分別增加19.64%、18.21% 和17.99%；白光處理增加最少，僅為對照(D)的1.05倍。光照處理下小麥芽苗中結合酚含量顯著高于游離酚含量(P<0.05)，且經過光照處理后，結合酚增加幅度大于游離酚。與對照相比，光照處理顯著增加了小麥芽苗中結合酚含量。黃光處理下結合酚含量最高，是對照的1.33 倍。藍光、綠光和黃光處理顯著提高了小麥芽苗中游離酚含量，其中以藍光處理為最高，達到858.65 mg GAE/100 g DW，較對照增加12.40 %。

注：同一顏色柱子上不同小寫字母表示不同處理間存在顯著差異(P<0.05)。

2.3 小麥芽苗酚酸含量

不同光質對小麥芽苗中6種主要酚酸含量的影響見表2。小麥芽苗中酚酸以結合態和游離態形式存在，其中阿魏酸最高，達2 420.59～2 668.53 μg/g DW。

表2 不同光質處理下小麥芽苗酚酸含量變化

綠光處理顯著增加了小麥芽苗總阿魏酸質量分數，較對照(D)增加了10.24%，其他光質處理對總阿魏酸含量無顯著影響。結合態阿魏酸是小麥芽苗中阿魏酸的主要形式，其占總阿魏酸質量分數的76.77%～83.52%。光照處理顯著增加了結合態阿魏酸含量，其中綠光處理下結合態阿魏酸含量最高，是對照的1.12倍。而光照處理顯著降低了游離態阿魏酸含量。表明光處理使小麥芽苗中阿魏酸由游離態向結合態轉化。

光照處理顯著增加了小麥芽苗中總對香豆酸含量，其中黃光處理下總對香豆酸含量最高，較對照增加78.36%。除黃光外，其余光處理顯著降低了游離態對香豆酸質量分數，降低了15.13%～47.07%；同時，結合態對香豆酸質量分數顯著提高，較對照增加43.95%～85.61%。

綠光和黃光處理下總咖啡酸含量顯著增加，分別為對照的1.16 倍和1.25 倍。白光處理顯著降低了總咖啡酸含量。小麥芽苗中咖啡酸主要以游離態形式存在，其占總咖啡酸的78.51%～87.65%。與對照相比，黃光和綠光顯著增加了游離態咖啡酸含量，分別為對照的1.11倍和1.26倍。光照處理均顯著增加了結合態咖啡酸含量，其中黃光處理下最高，是對照的1.35 倍。

與對照相比，光照處理均顯著增加了總香草酸含量，綠光和黃光處理顯著增加了丁香酸總含量，藍光、紅光和白光處理顯著增加總芥子酸含量。

2.4 小麥芽苗酚酸合成關鍵酶活力

如圖3a所示，發芽4 d時，白光、紅光和黃光處理下PAL活力相較于對照(D)分別增加19.13%、34.82%和30.67%，藍光和綠光處理下PAL活力與對照無顯著差異。發芽6 d時，各光質處理下PAL活力均顯著高于對照，其中綠光處理下小麥幼苗中PAL活力最高，是對照的1.51 倍，其次是黃光和藍光，分別為對照的1.48 倍和1.45 倍。不同發芽時間下光照對C4H的影響存在差異。發芽4 d時，光照處理對小麥苗C4H活力無顯著影響，但在發芽6 d時，光照處理均顯著提升了C4H活力，且綠光處理下C4H活力最高，是對照的2.29 倍(圖3b)。不同的光質處理均顯著提升了4CL活力，且綠光處理下4CL活力最高(圖3c)。

圖3 不同光質處理下小麥芽苗酚類合成關鍵酶活力變化

2.5 小麥芽苗酚類合成基因表達

如圖4a所示，發芽4 d時，白光和綠光處理下PAL表達量較對照(D)分別增加了26.67%和31.50%；發芽6 d時，除紅光外，其他光質處理顯著增加了PAL表達量，其中藍光處理下PAL表達量最高，是對照的1.54 倍。由圖4b可知，發芽4 d時，綠光和黃光處理顯著提高了小麥芽苗中C4H表達量，分別是對照的1.31 倍和1.29 倍；發芽6 d時，光照處理顯著提高了小麥芽苗C4H表達量，且綠光處理組C4H表達量最高。4CL表達量在光照處理下顯著增加，發芽4 d時，綠光處理組4CL表達量最高，是對照的2.13倍；發芽6 d時，藍光處理組4CL表達量最高，是對照的2.27倍(圖4c)。

圖4 不同光質處理下小麥芽苗PAL(a)、C4H(b)和4CL(c)表達量變化

2.6 小麥芽苗抗氧化能力

由圖5可知，與對照(D)相比，藍光、綠光和黃光處理顯著增加了小麥芽苗DPPH·和ABTS+·清除能力，各處理組中結合酚的DPPH·和ABTS+·清除活性均顯著高于游離酚，這與不同光質處理下總酚含量的變化趨勢一致。游離酚中，藍光、綠光和黃光處理組DPPH·清除活性分別是對照的1.15倍、1.15倍和1.14倍，ABTS+·清除活性分別是對照的1.13倍、1.18倍和1.21倍。結合酚中，藍光、綠光和黃光處理組DPPH·清除活性分別是對照的1.30倍、1.35倍和1.31倍，ABTS+·清除活性分別是對照的1.12倍、1.18倍和1.14倍。

圖5 不同光質處理小麥芽苗ABTS +·和DPPH·清除能力變化

3 討論

作為冷光源的LED具有光譜集中、光效高、波長類型豐富、光量可調節、環境友好等優點，近年來被廣泛應用于設施作物的生理研究與生產中。研究表明，紅光在增加小麥芽苗長度、促進細胞呼吸和干物質積累方面有重要作用[21]。本研究發現，紅光和黃光顯著提高了小麥芽苗的苗長和鮮/干質量比，增加小麥芽苗產量和提高營養價值[22]。另外，紅光對小麥芽苗根長的抑制最為顯著，這與黃瓜和蘿卜離體培養中紅光抑制根的生長結果一致[23,24]。光在刺激葉片伸展和葉肉細胞分化的同時，促進原質體或黃化體向葉綠體轉化[25]。本研究中，小麥芽苗經光照處理后葉綠素含量增加，且在單色光中以紅光處理下總葉綠素和葉綠素a含量最高。據報道[25]，紅光可顯著提高葉綠素a/b比值，改善葉色。因此，食品用小麥芽苗生產中可以適度提高紅光的比例，以增加葉綠素含量。

植物生長發育受到外界環境的影響，幼苗對外界環境的變化尤為敏感。本研究使用LED光源通過精確調節光譜，系統研究了光質對小麥芽苗中酚類化合物積累的影響。小麥芽苗經光照處理后總酚含量(圖2)及多種酚酸含量(表2)均有顯著增加，其中藍光、綠光和黃光更有利于酚類物質的積累和增強抗氧化能力(圖5)。這可能與緩解植物在單色光脅迫下產生的膜脂過氧化傷害有關[26]。研究表明，UV-B輻射會引起植物體氧化應激反應，抗氧化酶被激活，同時酚類、抗壞血酸和谷胱甘肽等抗氧化物質大量合成，在不同單色光處理下植次級代謝產物的積累可能是植物應對外界環境改變的一種自我防御機制[27]。當植物處于光脅迫時，光合作用和生物量的積累顯著降低，但會形成酚類化合物等次生代謝產物，以此提高其抗氧化性。本研究中，光照處理顯著提高了小麥芽苗游離和結合酚提取物 DPPH·和 ABTS+·清除能力，特別是藍光、綠光和黃光對清除率的增加最為顯著，表明酚類物質在提高小麥芽苗抗氧化活性方面發揮了重要作用(圖5)。植物生長過程中細胞分裂、體積增大，而細胞壁中木質素合成與酚類物質代謝相關，在植物形成木質素的過程中，產生各種酚類中間代謝產物[28]。本研究發現阿魏酸、p-香豆酸和咖啡酸是小麥芽苗中主要的酚酸(表2)，這與Chen等[27]的研究結果一致。藍光、綠光和黃光處理顯著提高了小麥芽苗中結合態阿魏酸、p-香豆酸和咖啡酸含量。這可能與單色光激活小麥芽苗的防御體系，從而激活苯丙烷類及木質素合成代謝途徑，進而引起p-香豆酸和阿魏酸的大量形成與積累[27]。香草酸和丁香酸在小麥芽苗中含量較低(表2)，光照對兩者的影響較小。

植物中酚類化合物的合成主要通過苯丙烷類代謝途徑，其含量的增加與苯丙烷代謝途徑中關鍵酶基因表達及其酶的活力有關[29]。苯丙烷途徑基因表達可以被光激活[30]。PAL是該途徑的限速酶，本研究中PAL表達量與小麥芽苗中阿魏酸、對香豆酸和咖啡酸的積累成正相關(圖4和表2)，表明PAL表達量及其酶活力的增加使酚類物質得以積累。本研究結果顯示，藍光、綠光和黃光處理可提高小麥芽苗苯丙烷代謝途徑中關鍵基因C4H和4CL的表達量及其酶活性，從而促進酚類物質的積累，這與Liu等[26]和魯燕舞等[13]的研究結果一致。綠光處理下小麥芽苗有最高的PAL、C4H和4CL表達量及對應的酶活力，因而綠光照射有助于刺激苯丙烷代謝途徑，加速小麥芽苗中酚類物質的合成，這為富含抗氧化物質的功能性小麥芽苗食品開發提供了原料。

4 結論

紅光和黃光顯著增加小麥芽苗的芽長和鮮/干質量比，促進生長。藍光、綠光和黃光更利于增加小麥芽苗中總酚和酚酸含量，提高抗氧化能力。與對照相比，藍光、綠光和黃光處理下總酚質量分數增加了17.99%、18.21%和19.64%。阿魏酸、對香豆酸和咖啡酸在藍光、綠光和黃光處理下顯著提高。藍光、綠光和黃光通過上調小麥芽苗中PAL、C4H和4CL的表達，提升相應酶活力，促進了酚類物質的合成與積累，從而增強小麥芽苗抗氧化能力。