食品中米酵菌酸測定方法研究進展

(董憲兵 趙 博 周純潔 候美玲 吳彥蕾

(重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶 401121)

椰毒伯克霍爾德菌可以產生兩種毒素，分別是米酵菌酸(Bongkrek acid)和毒黃素(Toxoflavin)，兩者共同導致了中毒癥狀，米酵菌酸的毒性更強。米酵菌酸是一種熱穩定的高度不飽和的三羧酸脂肪酸，具有很強的生物活性，是椰毒假單胞菌引起食物中毒和死亡的主要毒性代謝產物，在20世紀30年代，由荷蘭學者Merten和Vanveen發現[1]。米酵菌酸基本無味，很難察覺，其耐熱性極強，即使用100℃的開水煮沸或用高壓鍋蒸煮也不能破壞其毒性，進食后即可引起中毒。多種食物如自制谷類發酵食品、銀耳和木耳等易受椰毒假單胞菌污染而產生米酵菌酸毒素，食用含有該毒素污染的食物會引起人或動物中毒，目前對米酵菌酸尚無特效解毒藥物，一旦中毒，病死率在40%～100%。近年來，我國發生過多起因食用含有米酵菌酸的食品導致中毒死亡的事件。如2012年山東省臨沂市，2014年云南文山州，2018年廣東省東莞市，2020黑龍江均發生食用被米酵菌酸污染的食品導致的中毒死亡事件[2-5]。因此，對食品中米酵菌酸的檢測是不可或缺的。目前，對食品中米酵菌酸的檢測方法主要有薄層色譜法、紫外分光光度法、液相色譜法、液相色譜串聯質譜法以及近年來發展起來的液相色譜串聯質譜/質譜法、超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜法等。

1 食品中米酵菌酸檢測方法

1.1 薄層色譜法

薄層色譜法是將吸附劑或支持劑在玻璃或塑料板涂一薄層，將待分析樣品滴加到薄層上，然后用適當的溶劑展開而達到分離，鑒定和定量分析的目的，具有樣品需求量少，設備要求簡單和檢測速度快等優點[6]。薄層色譜法多用于食品中生物活性的測定、蜂蜜的鑒別、生物堿成分分析等領域[7-9]。早期國內外學者把薄層色譜法應用到米酵菌酸的測定，胡文娟等[10]對酵米面和銀耳中的米酵菌酸的提取和薄層分離條件進行了研究，建立了測定酵米面和銀耳中的米酵菌酸的薄層色譜法。HU等[11]用交聯葡聚糖LH-20凝膠過濾和C-18反相柱層析法從玉米粉中分離出米酵菌酸，并用薄層色譜法進行識別和分析。薄層色譜法對食品中米酵菌酸測定的應用較早，但是因其步驟復雜，靈敏度低，不適合大批量樣品的檢測而逐漸被其他檢測方法替代。

1.2 分光光度法

分光光度法測定食品中的米酵菌酸，以其操作簡單，儀器價格低廉為主要特點，是實驗室分析使用的分析方法。2018年馬忠賓等[12]建立了紫外分光光度法測定食品中的米酵菌酸，并申請了相關專利，該方法用氨水甲醇溶液作為提取溶劑，處理粉碎后的樣品加入溶劑經震蕩、超聲、提取、分液加入碳酸氫鈉溶液分離，加入石油醚分離后濃縮，最后用甲醇溶解后在紫外分光光度計上比色進行測定。閻立榮[13]應用線性組合導數的統計學方法建立了能同時測定米酵菌酸和毒黃素的分光光度法，此方法克服了各種組分波長嚴重重疊時難以測定的困難，具有選擇性強，精密度好的優點。黃建立[14]用紫外分光光度法測定變質銀耳中米酵菌酸含量，并與高效液相色譜法的測定結果進行對比，結果表明測定結果無顯著差異。但是分光光度法在測定食品米酵菌酸中存在專屬性差，靈敏度低的缺點。

1.3 高效液相色譜法

高效液相色譜法測定食品中的米酵菌酸應用研究非常廣泛，GB 5009.189—2016 《食品安全國家標準 食品中米酵菌酸的測定》中也是用高效液相色譜法測定米酵菌酸，但國標測定范圍適用于銀耳及其制品、酵米面及其制品，其他食品類別中的米酵菌酸的測定還沒有相關的標準，而且該標準方法前處理過程繁瑣、有機試劑消耗量大，難以實現樣品批量處理。俞穗珍[15]在參照標準的方法基礎上，通過優化的固相萃取方法，提取工藝，進樣量的大小，選擇流動相pH 值大小，探索出更加快速、便捷、準確的方法來測定新鮮銀耳中的米酵菌酸，縮短了樣品前處理周期，減少了有機試劑的消耗量，節約了成本。侯佰立[16]應用固相萃取技術并結合高效液相色譜儀建立了固相萃取-高效液相色譜測定食品中米酵菌酸殘留的方法，該方法用甲醇和氨水作為提取溶劑，經混合型強陰離子固相萃取柱凈化，濃縮過濾后用高效液相色譜儀在267 nm紫外波長處進行分析。結果表明米酵菌酸測定結果在一定線性范圍內線性良好，R2為0.999 7，回收率高。李紅艷等[17]通過考察樣品的不同提取條件和不同固相萃取柱的凈化效果，建立了混合型弱陰離子固相萃取富集凈化，高效液相色譜-二極管陣列檢測器快速測定食品中米酵菌酸殘留的方法。該方法以80%乙腈水為提起溶劑，經WAX固相萃取小柱凈化，以269 nm為分析波長進行分析，米酵菌酸在0.1～40 mg/L質量濃度范圍內線性良好,相關系數r值大于0.999。石聲鑫[18]比較了不同提取溶劑和不同萃取工藝對食品中米酵菌酸提取效率的影響，建立了高效液相色譜-二極管陣列檢測器測定食品中米酵菌酸殘留的方法。蘇永恒[19]優化了液相色譜的色譜條件、提取和凈化條件，建立了固相萃取-高效液相色譜方法測定食品中米酵菌酸含量，可滿足食品中米酵菌酸含量的檢測要求。周霞[20]采用C18色譜柱，以甲醇和1%乙酸為流動相，檢測波長為267 nm，建立混合型強陰離子(MAX)全自動固相萃取富集凈化，超高效液相色譜法快速檢測食品中米酵菌酸殘留量。但高效液相色譜法分析時間較長，易受樣品基質干擾致使定性定量出現偏差，對低濃度樣品定性能力不夠，樣品取樣量較大。

1.4 高效液相色譜-串聯質譜法

隨著檢測行業的飛速發展，超高效液相色譜-串聯質譜法的應用越來越普及。相對液相色譜法，超高效液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)前處理更加簡單，分析時間短，專屬性好，靈敏度高，適合大批量樣品的快速檢測。蘇肯明[21]采用甲醇：0.02 M乙酸銨緩沖溶液(85∶15)為流動相，用電噴霧負離子源(ESI-)進行離子化，多反應監測掃描(MRM)對米酵菌酸的母離子及子離子進行監測，建立了液相色譜-串聯質譜法測定銀耳中的米酵菌酸的新方法。周鵬[22]把粉碎后的銀耳樣品用甲醇提取，混合強陰離子交換固相萃取柱(PAX)凈化，UPLC BEH C18(2.1×100 mm,1.7 μm)色譜柱分析，以10 mmol/L乙酸銨-乙腈為流動相，梯度洗脫，串聯四級桿質譜多反應監測負離子模式檢測，基質匹配外標法定量，建立了快速測定銀耳中米酵菌酸的超高效液相色譜串聯質譜分析方法。曾令浩[23]建立高效液相色譜-串聯質譜法快速檢測銀耳中的米酵菌酸的方法。銀耳樣品用甲醇提取后，超聲振蕩，離心分層，上清液用甲醇定容。使用空白基質液配置標準曲線對結果進行校正，在優化后的色譜及質譜條件下，采用負離子模式進行電離，并通過多反應監測模式對目標化合物的定量離子和定性離子進行測定。覃冬杰[24]建立超高效液相色譜-串聯質譜法測定柳州螺螄粉中米酵菌酸的分析方法，該方法通過優化色譜和質譜方法(色譜柱、流動相、質譜條件)、提取條件(提取溶劑的選擇)、凈化條件的選擇，并設計正交試驗得到最佳的螺螄粉中的米酵菌酸的測定方法。曾雪芳[25]研究了不同基質米粉和河粉中的米酵菌酸的測定方法，試樣經提取，凈化，濃縮及過濾后，以0.1%甲酸水和乙腈作為流動相進行梯度洗脫，采用電噴霧離子源負模式檢測，外標法定量。基于米酵菌酸色譜和質譜行為的研究，對其儀器測定條件進行優化，并對優化后的方法進行方法學驗證，結果表明該方法靈敏度高，專屬性好，準確可靠，適用于米粉和河粉基質中米酵菌酸的測定。李紅娜等[26]建立了用液相色譜與飛行時間質譜聯用測定配方米粉中米酵菌酸的方法，該方法快速簡單。用高效液相色譜串聯質譜法測定米酵菌酸不僅在食品領域得到廣泛應用，在中藥和刑偵檢驗領域都得到了廣泛的應用[27-29]。

1.5 超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜

隨著檢測技術的不斷發展，質譜技術的廣發應用，相對于常規的超高效液相色譜-串聯質譜法使用多反應監測模式通過目標物的離子對進行定量分析，超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜(UPLC-Q-OrbitrapHRMS)具有分辨率高及定量能力好的優點，利用目標物母離子的精確分子量直接定量，無需對目標物逐個優化子離子及相關參數，對于多目標物分析可以極大地降低檢測方法的時間，同時又能很好地避免低分辨質譜易受基質干擾而產生假陽性的現象[30，31]。針對目前測定米酵菌酸的前處理過程均需要使用混合型陰離子固相萃取柱進行凈化，耗時長、溶劑消耗大的問題，梁明[32]建立了QuEChERS+EMR-Lipid結合超高效液相色譜-四極桿_靜電場軌道阱高分辨質譜快速測定河粉中的米酵菌酸的方法，該方法采用 QuEChERSEMR-Lipid技術對樣品進行凈化，可以大大縮短前處理時間。并且選用高分辨質譜對處理后的樣品進行測定，提高方法的準確性和靈敏度。此方法大大縮短前處理時間，提高食品中米酵菌酸的檢測分析效率。 Liang等[33]應用納米管技術結合高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜建立了米粉中米酵菌酸的測定方法，并設計了響應面對前處理方法進行了優化，結果表明該方法適用于米粉中米酵菌酸的測定，回收率為79.8%～102.6%，相對標準偏差(RSD)為4.2%～7.1%。超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜法簡化了分析步驟，提高了分析效率和檢測準確性，但是該方法配套儀器購買成本較高，儀器后期維護保養成本較高，使該方法的推廣普及受到一定的限制。

2 結論與展望

近年來食品中米酵菌酸污染而引發的中毒事件時有發生，目前國內對米酵菌酸污染的監管還處于比較薄弱的環節，許多學者對米酵菌酸的測定方法進行了大量研究，并且不斷的改進。隨著監管部門對米酵菌酸污染問題的重視，米酵菌酸污染將會納入監管范疇，但是目前只有GB 5009.189—2016這一項食品安全國家標準，該標準應用液相色譜法對米酵菌酸測定，該方法樣品需求量較大，前處理步驟復雜，溶劑消耗量大。目前，急需開發更加快速、準確的檢測方法將成為該領域重點研究方向之一。隨著實際檢測需求和技術水平的不斷提高，色譜檢測技術已經逐漸由低分辨向高分辨方向發展，以滿足建立高靈敏度、高選擇性、高分析通量、簡便快速實用分析方法的需要。