壺瓶碎米薺多糖硫酸化結構修飾及抗氧化活性研究

(張子木 黃秀芳 張 琴 李美東 張 馳 羅 凱

(湖北民族大學生物科學與技術學院，恩施 445000)

壺瓶碎米薺(Cardaminehupingshanensis)是十字花科碎米薺屬植物，主要分布于我國湖南省和湖北省。由于其富硒的特性而被熟知和開發利用。目前壺瓶碎米薺的相關研究主要集中在黃酮的抗氧化和多糖的提取方式等方面。例如張春燕等[1]研究表明壺瓶碎米薺含硒粗黃酮對自由基具有一定的清除作用，除超氧陰離子外，其余測定的自由基均顯示出良好的抗氧化效果；羅凱等[2]通過響應面法優化了酶法提取壺瓶碎米薺多糖，實驗結果得出酶解時間91.8 min，酶解溫度57.1 ℃，酶解pH 4.17。在此條件下，碎米薺粗多糖提取率最高。而目前對壺瓶碎米薺多糖進行結構修飾并研究其活性鮮有文獻報道。近年來，多糖由于其抗氧化、抗凝血、降血糖、免疫調節和抗腫瘤活性等多種功能和生物活性，在食品和生物醫學領域得到了廣泛的研究[3-7]。多糖的化學修飾可以提高其內在的生物活性從而產生新的功能性質[8]。多糖的改性方法主要有硫酸酯化、磷酸化、乙酰基化和羧甲基化這4種結構修飾的方法[9]。Chen等[10]對大蒜多糖對其進行磷酸化修飾，大蒜多糖在磷酸化前后均具有清除羥自由基和超氧陰離子的能力。在一定范圍內，大蒜多糖濃度越高抗氧化能力越強。且磷酸化后的衍生物具有更強的抗氧化能力；Liu等[11]采用乙酰化修飾了青錢柳多糖，乙?；噱X柳多糖能顯著刺激巨噬細胞增殖，其作用明顯強于相應的未改性多糖；Li等[12]利用硫酸基團鏈接在綠紅菇多糖長鏈上。體外活性實驗表明，硫酸化綠紅菇多糖具有較好的抗氧化、抗凝血、抗菌和抗腫瘤活性。硫酸化修飾是一種通過硫酸基部分取代羥基來修飾多糖生物活性的有效而簡便的方法。多糖硫酸化不僅可以提高其水溶性，而且可以改變多糖鏈的構象，從而改變其生物活性。尤其是硫酸酯化多糖的抗凝、抗氧化、抗菌和抗腫瘤活性。壺瓶碎米薺多糖本身具有其良好的抗氧化、抑制腫瘤等活性，但水溶性較差。目前鮮有壺瓶碎米薺多糖改性的相關研究，因此本實驗針對壺瓶碎米薺多糖進行硫酸化修飾，改善其水溶性特點，并利用硫酸化壺瓶碎米薺多糖研究其清除ABTS自由基、羥自由基、DPPH自由基的能力，以期為深入研究硫酸化壺瓶碎米薺多糖的分子結構和抗腫瘤活性以及壺瓶碎米薺功能食品開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

壺瓶碎米薺；三氧化硫-吡啶絡合物(SO3-pry)、無水二甲基亞砜；二乙氨基乙基纖維素(DEAE-52)；ABTS、DPPH為色譜純；其他試劑為分析純。

1.2 壺瓶碎米薺多糖的制備

將壺瓶碎米薺烘干后，用超微粉碎器打粉過100目篩。將處理好的粉與蒸餾水混合均勻(1∶30)后80 ℃煮2.5 h后過濾保留濾液。將濾液減壓濃縮至原體積的20%，經過多次除蛋白后，加入無水乙醇進行醇沉。4 ℃靜置過夜后離心的得到壺瓶碎米薺粗多糖。將粗碎米薺多糖溶于蒸餾水(5 mg/mL)中，注入二乙氨乙基(DEAE)纖維素-52柱(2.6 cm×30 cm)。隨后用蒸餾水洗脫柱。再將濾液進行收集、濃縮、凍干得到壺瓶碎米薺多糖(CHP)。

1.3 壺瓶碎米薺多糖硫酸化

采用三氧化硫-吡啶法[13]并做一定修改。將200 mgCHP溶入60 mL無水二甲基亞砜中，室溫攪拌1 h，等待CHP完全分散于無水二甲基亞砜中，再加入不同質量比的三氧化硫-吡啶(CHP∶SO3·Pry=1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/g)，將混合物在55 ℃的條件下攪拌2 h，待反應結束后，用冰水浴冷卻至室溫，并添加1 mol/L的NaOH中和，然后用3 500 u截流量的透析袋用自來水透析2 d后再用蒸餾水透析3 d。透析液取出旋轉蒸發后醇沉過夜離心再冷凍干燥，得到凍干硫酸鹽壺瓶碎米薺多糖(SCHP)。硫酸化壺瓶碎米薺多糖分別命名為SCHP1-10、SCHP1-15、SCHP1-20、SCHP1-25、SCHP1-30。

1.4 壺瓶碎米薺硫酸多糖特性測定

1.4.1 硫酸化修飾碎米薺多糖取代度測定

用氯化鋇-明膠法[14]估算硫酸多糖的硫含量，以硫酸鈉為標準品，建立標準曲線。取代度(DS)是每個糖渣上硫酸鹽基團的平均數，根據硫含量(S)計算，公式為：

1.4.2 傅里葉變換紅外光譜分析

在掃描范圍為4 000～400 cm-1的Nicolet is5光譜儀上進行傅里葉變換紅外光譜(FTIR)分析。將干燥后的多糖樣品與KBr按照1∶150的質量比混勻后真空干燥1 h后，壓制成薄片進行FTIR測定。

1.5 抗氧化活性測定

1.5.1 ABTS自由基清除活性

用Hong[15]的方法檢測ABTS+·的清除率。ABTS原液由7 mmol/L ABTS水溶液與 4.9 mmol/L過硫酸鉀在室溫下反應生成。儲備液在4 ℃黑暗環境中保存16 h，然后用乙醇稀釋，在734 nm處得到吸光度為(0.70±0.02)。將200 μL不同取代度的SCHP與4.0mL稀釋的ABTS+·溶液混合，在黑暗中反應6 min立即在734 nm處檢測吸光度值。以VC為陽性對照。

式中：A1為4 mL ABTS+200 μL SCHP；A0為4 mL UP水+200 μL SCHP；A2為4 mL ABTS+200 μL UP水。

1.5.2 羥自由基清除活性

參照Dong[16]的方法檢測羥自由基清除率，略作修改。將不同取代度的硫酸化壺瓶碎米薺多糖(SCHP)用超純水配制不同濃度的樣液后取2 mL與2.0 mL的0.009 mol/L FeSO4溶液、2.0 mL的0.009 mol/L水楊酸乙醇溶液和2.0 mL的8.8 mmol/L H2O2混合。然后將反應混合物在37 ℃下孵育30 min。測量混合物在510 nm處的吸光度。以VC為陽性對照。

式中：A1為蒸餾水代替H2O2吸光度；A2為蒸餾水代替樣品吸光度；A0為樣品吸光度。

1.5.3 DPPH自由基清除活性

參照Xiong等[17]的檢測方法進行并作修改。DPPH溶液由無水乙醇配制，然后用無水乙醇稀釋，在517nm處得到吸光度為(0.6±0.02)。等量添加不同濃度SCHP樣液與2×10-5mol/L DPPH溶液充分搖勻。在黑暗環境中反應0.5 h。結束后立即在517 nm處測量吸光度值。VC作為陽性對照。

式中：A1為2 mL多糖樣液+2 mL無水乙醇；A2為2 mL DPPH+2 mL蒸餾水；A0為2 mL DPPH+2 mL SCHP

1.6 溶解度測定

將500 μL離心管烘干至恒重后稱重，取100 μL蒸餾水加入離心管后稱重。每次加入10 mg樣品搖勻觀察是否溶液飽和。飽和后離心去除上清液烘干至恒重。溶解度計算公式：

1.7 數據處理

所有實驗均進行3次平行實驗，利用Origin 8.0軟件與SPSS 25軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 取代度分析

分別在1、2、4 d測定標準曲線，取3次平均值。硫酸根與吸光度的回歸方程為y=1.341 7x+0.024，R2為0.992 1，方程線性關系良好。根據方程測得樣品SCHP1-10、SCHP1-15、SCHP1-20、SCHP1-25、SCHP1-30取代度如圖1所示，分別為0.46、0.55、0.69、0.72、0.80。硫酸化多糖的取代度(DS)是一個重要的生物活性參數。在硫酸化改性反應中，酯化劑的用量是影響硫酸化化衍生物DS的關鍵因素。因此，采用5種不同質量比的多糖與SO3-Pry制備了具有不同DS的硫酸化多糖并對所有多糖的DS進行了分析，結果顯示壺瓶碎米薺多糖硫酸化反應呈梯度增加，其中未改性多糖取代度為0，而隨著硫酸化改后SO3-Pry劑量的增加多糖的取代度數值逐漸增加，SCHP的DS從0.46增加到0.80，其中SCHP1-30的DS最高。結果顯示提高SO3-Pry劑量有利于多糖的硫酸化反應，但隨著SO3-Pry劑量的增加多糖的得率出現下降，推測由于過量的SO3-Pry會導致多糖在反應時產生裂解等從而降低了DS硫酸化多糖的得率。

2.2 溶解度分析

在多糖純化的過程中，純化程度增加會導致溶解性減小，限制了其使用范圍。通過對壺瓶碎米薺多糖進行硫酸化修飾，其水溶性增加明顯。如圖1所示，未經硫酸化修飾的壺瓶碎米薺多糖溶解度為18.5 g/100 g，而經硫酸化修飾后的壺瓶碎米薺溶解度有很大的提高。根據圖1分析發現，經硫酸化修飾后壺瓶碎米薺多糖的溶解度平均提高3倍以上。說明硫酸化修飾壺瓶碎米薺多糖可以提高壺瓶碎米薺多糖的水溶性。但隨著硫酸化壺瓶碎米薺多糖取

圖1 不同取代試劑用量對壺瓶碎米薺多糖硫酸化改性以及得率的影響

代度的增加，其溶解度變化較小。說明硫酸化程度的增加對進一步提高其溶解度影響較小。

2.3 改性壺瓶碎米薺多糖FTIR分析

圖2 壺瓶碎米薺多糖與硫酸化改性壺瓶碎米薺多糖紅外光譜檢測分析

2.4 硫酸化改性壺瓶碎米薺多糖體外抗氧化活性研究結果

2.4.1 硫酸化改性前后壺瓶碎米薺多糖對ABTS自由基清除活性

ABTS主要用來檢測總自由基[19]， ABTS原液在避光反應16 h后生成穩定的自由基，反應時，樣品如果具有抗氧化性會使ABTS溶液褪色，褪色程度越大證明抗氧化性越好。如圖3所示，SCHP隨著取代度的增加其抗氧化性也隨之增加，SCHP對ABTS自由基的清除率與濃度呈正相關。相對于未改性的壺瓶碎米薺多糖，經過硫酸化修飾后的壺瓶碎米薺多糖對ABTS自由基的清除率有明顯的提升，其SCHP1-30的清除能力最好，SCHP1-10清除能力最差。這表明較高取代度的壺瓶碎米薺多糖可以提高對ABTS自由基的清除能力。結果與Seedevi等[20]的研究結果一致，取代度較高的硫酸化多糖對ABTS自由基的清除率較高，但5種不同取代度的硫酸化壺瓶碎米薺多糖對ABTS自由基的清除率均低于50%。

圖3 壺瓶碎米薺多糖與硫酸化改性壺瓶碎米薺多糖對ABTS自由基清除率的影響

2.4.2 硫酸化改性前后壺瓶碎米薺多糖對羥自由基清除活性

研究表明羥自由基是所有自由基中最具有攻擊性的，主要由線粒體電子傳遞系統產生[21]。羥自由基在人體中主要與某些蛋白質、核酸和酶類等產生自由基鏈式反應[22]。并且羥自由基可直接導致細胞膜的損傷從而破壞某些細胞[23]。針對羥自由基的清除是目前預防疾病最好的方法之一[24]。如圖4所示，不同取代度的SCHP在一定濃度范圍內對羥自由基清除對濃度有一定的相關性，但清除羥自由基的能力并沒有完全隨著SCHP的取代度的增加而增加。在3 mg/mL的條件下，SCHP1-25的清除率就高于SCHP1-30。而在5 mg/mL的濃度下SCHP1-30的清除率高于SCHP1-25，其IC50也高于SCHP1-25。但是在SCHP1-10～SCHP1-20范圍，其清除能力隨著取代度的增加而增加。造成這種現象的原因可能是由于高取代度的CHP由于硫酸基團引入過多，造成了多糖長鏈的分解，從而影響了低濃度SCHP1-30對羥自由基清除能力。隨著濃度的提高SCHP對羥自由基清除能力也隨之提高，但較高取代度的硫酸化壺瓶碎米薺多糖對羥自由基清除能力比未修飾的壺瓶碎米薺多糖有一定程度的提高，而較低取代度的SCHP1-10、SCHP1-15、SCHP1-20的清除羥自由基能力則低于未修飾的壺瓶碎米薺多糖。SCHP1-25和SCHP1-30的IC50分別為4.60、4.51 mg/mL。其余3種取代度的硫酸化壺瓶碎米薺多糖的IC50由于抑制率過低無法計算。

圖4 壺瓶碎米薺多糖與硫酸化改性壺瓶碎米薺多糖對羥自由基清除率的影響

2.4.3 DPPH自由基清除活性

DPPH是一種非常穩定的自由基[25]，與氧化劑反應，易生成氫離子，其顏色從深紫色變為淺黃色，經過無水乙醇溶解后，在紫外517 nm處有明顯的吸收峰，故可利用這一特性檢測DPPH的清除率。由圖5可見，在1～5 mg/mL的范圍中，對DPPH的清除能力隨著取代度的增加而增加。其濃度越大清除能力越大。SCHP1-30的清除能力接近VC。相比較于未改性的CHP，經過硫酸化修飾后的CHP在對DPPH清除能力上都有所提高。在中等濃度條件下，改性后的壺瓶碎米薺多糖比未改性壺瓶碎米薺多糖對DPPH清除率也有所提高。即使是較低濃度條件下SCHP1-20、SCHP1-25、SCHP1-30也分別提高了31.5%、50.6%、72.8%。這表明硫酸化修飾有助于提高壺瓶碎米薺多糖的DPPH清除能力，結果與Hu等[26]的研究結果一致。SCHP1-25的IC50由于其構建的方程R2為0.611 3，相關性較差而無法計算，SCHP1-30的IC50在濃度為1mg/mL時的清除率已經達到86.81%，超出計算范圍而無法計算。

圖5 壺瓶碎米薺多糖與硫酸化改性壺瓶碎米薺多糖對DPPH自由基清除率的影響

3 結論

采用三氧化硫-吡啶法對壺瓶碎米薺多糖進行了硫酸化修飾，并得到了5種不同取代度(0.46～0.80)的硫酸化壺瓶碎米薺多糖。紅外結果顯示硫酸化修飾成功，其硫酸基團主要連接在壺瓶碎米薺多糖的C-6位上。通過硫酸化修飾壺瓶碎米薺多糖可以在一定程度上提高壺瓶碎米薺多糖抗氧化能力，但其抗氧化活性均不如VC好。硫酸化改性后的壺瓶碎米薺多糖其溶解性得到了較好的改善。研究為后續壺瓶碎米薺多糖的結構以及生物活性研究提供了參考，后續可對硫酸化改性壺瓶碎米薺多糖進行分離純化、結構鑒定以及抗腫瘤等生物活性的深入研究。