超聲輔助β-環糊精包合法提取紫蘇籽油α-亞麻酸工藝研究

(王 亞 范玲玲 馬挺軍

(北京農學院食品科學與工程學院1，北京 102206)

(鄂倫春自治旗大楊樹榮盛商貿有限責任公司2，呼倫貝爾 021000)

紫蘇[Prillafrutescens(L.) Brittt.]，別名荏、紅蘇、赤蘇、白蘇、灰蘇、蘇子等，為唇形科紫蘇屬一年生草本植物，是亞洲起源中心起源農作物，我國種植紫蘇已有300 0多年的歷史[1]。紫蘇籽油是由紫蘇籽經提取所得到的植物油，紫蘇籽油中含有α-亞麻酸、油酸、亞油酸、硬脂酸等脂肪酸，其中α-亞麻酸的純度高達60%以上[2，3]。α-亞麻酸(α-Linolenic acid) 即9，12，15-十八碳三烯酸，是n-3系列不飽和脂肪酸[4]。α-亞麻酸作為一種不能自身合成的多不飽和脂肪酸，在人體內會轉化為二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，即EPA和DHA[5]。據報道，這類n-3系列不飽和脂肪酸具有降血脂、降血糖、提高記憶力、抗癌[6-8]等功效。

目前常規的α-亞麻酸的提取工藝主要有尿素包合法、銀離子絡合法、冷凍結晶法、分子蒸餾法、柱層析法、超臨界流體萃取法等，利用尿素包合法提取α-亞麻酸包合時間長并且有機溶劑殘留[9]；銀離子絡合法成本較高，而且硝酸銀具有不穩定性，需要對銀離子進行回收[10]；冷凍結晶法需要回收大量溶劑，如正己烷等[11]；柱層析法溶劑使用量大，分離時間較長，能耗大，洗脫過程中使用的洗脫劑容易對產品造成二次污染，難以進行規?；a[12]；分子蒸餾難以分離相對分子質量相近的脂肪酸，設備要求較高，應用具有一定的局限性，不適合工業生產[13-14]；超臨界流體萃取法無法分離碳數相近的脂肪酸，且設備昂貴，成本較高[15]。

β-環糊精法采用內疏水、外親水的β-環糊精對油脂進行包合，可利用其內部疏水親脂作用與疏水性分子通過非共價鍵作用形成穩定包合物，而α-亞麻酸的結構式存在3個共軛雙鍵形成一種類似芳香環狀結構, β-環糊精的空腔中的羥基容易和芳香環結構形成新的氫鍵，因此β-環糊精更容易與α-亞麻酸包合[16]。β-環糊精屬于天然產品，無毒無害，且操作簡單，因此適合推廣到工業生產中[17]。超聲波輔助提取的原理主要是依據超聲波的機械效應、空化作用和熱效應，通過提高物質的分子運動速度，增大介質分子的穿透率，對活性物質進行提取[18，19]。利用超聲波在液體中傳播時產生的沖擊波，釋放能量，有利于環糊精與油脂包合過程的進行[20]，并且超聲波輔助在提取熱敏性物質和要求低溫加工的食品方面應用較為廣泛。α-亞麻酸具有熱不穩定性，容易氧化變質，因此，選取超聲代替普通機械攪拌輔助β-環糊精法對紫蘇籽油α-亞麻酸進行提取，對α-亞麻酸破壞較少，更有利于包合，相對于微波輔助提取成本更低。

目前使用β-環糊精法提取α-亞麻酸的研究較少，利用其對紫蘇籽油中的α-亞麻酸進行提取的更是少見。本研究通過超聲輔助β-環糊精法對紫蘇籽油中的α-亞麻酸進行提取，采用響應面優化工藝條件，為α-亞麻酸的提取及紫蘇籽油的開發利用提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇籽油 自購，經物理低溫壓榨法制成。

α-亞麻酸甲酯標準品(純度≥99%)、石油醚、β-環糊精、BF3-甲醇(55%～60%)、NaOH、鹽酸、無水乙醇、NaCl、無水硫酸鈉(均為分析純)、正己烷(色譜純)。

1.2 儀器與設備

RE-5203旋轉蒸發器；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；DH-101-2電熱恒溫鼓風干燥器；EKQ-700E型數控超聲波清洗器；BSA224S電子天平；HH-S數顯恒溫水浴鍋；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵；GC1120氣相色譜儀。

1.3 方法

1.3.1 脂肪酸組成的測定

取0.1 g樣品和5.6 mL 10%BF3-甲醇溶液置圓底燒瓶混勻后65 ℃磁力攪拌3 min，冷卻；加入5 mL正己烷磁力攪拌3 min；繼續加入5 mL飽和NaCl溶液，晃動燒瓶數分鐘后轉移至試管，靜置分層后取上層溶液適量加入無水硫酸鈉去除痕量水分，得到的甲酯化樣品即可備氣相色譜分析用。

氣相色譜條件：色譜柱：鍵合交聯聚乙二醇固定相，柱長30 m。柱溫箱溫度：起始溫度150 ℃，以10℃/min升溫至200 ℃，再以10 ℃/min升溫至230 ℃，保持15 min；進樣口溫度：250 ℃；進樣量1 μL，分流比20∶1；FID檢測器溫度：270 ℃；載氣：高純氮氣，流量：1.0 mL/min，尾吹：25 mL/min；氫氣：40mL/min；空氣：450 mL/min。

1.3.2 原料預處理

稱取5 g紫蘇籽油，加入20 mL5% NaOH乙醇溶液，混勻后充分皂化；適量水溶解皂化液后石油醚萃取3次，調節pH值至2～3左右，隨后取油層用純水沖洗至中性；干燥1 h后，即得紫蘇籽油混合脂肪酸。

稱取22.25 g β-環糊精4份，50 ℃水溶解，制成飽和溶液。精確稱取1 g紫蘇籽油和0.5 g無水乙醇(質量比2∶1)、1 g紫蘇籽油混合脂肪酸(FFA)和0.5 g無水乙醇、1 g紫蘇籽油、1 g紫蘇籽油FFA，混合均勻后分別加入β-環糊精過飽和溶液中，攪拌均勻后放置超聲波振蕩器中，50 ℃條件下超聲50 min，每10 min取出磁力攪拌30 s；待冷卻后，放置冰箱(-18 ℃)冷凍20 h后進行脫包合。

1.3.3 單因素實驗

1.3.3.1 料液比的選擇

稱取15、18.75、22.25、26.25、30 g β-環糊精，50 ℃水溶解，制成飽和溶液。精確稱取1 g紫蘇籽油和0.5 g無水乙醇(質量比2∶1)，混合均勻后加入β-環糊精過飽和溶液中(即為料液比10∶1、12.5∶1、15∶1、17.5∶1、20∶1)，攪拌均勻后放置超聲波振蕩器中，50 ℃條件下超聲70 min，每10 min取出磁力攪拌30 s；待冷卻后，放置冰箱(-18 ℃)冷凍20 h后進行脫包合。

1.3.3.2 超聲時間的選擇

稱取22.25 g β-環糊精，50 ℃水溶解，制成飽和溶液。精確稱取1 g紫蘇籽油和0.5 g無水乙醇(質量比2∶1)，混合均勻后加入β-環糊精過飽和溶液中，攪拌均勻后放置超聲波振蕩器中，50 ℃條件下超聲40、50、60、70、80 min，每10 min取出磁力攪拌30 s；待冷卻后，放置冰箱(-18 ℃)冷凍20 h后進行脫包合。

1.3.3.3 超聲溫度的選擇

稱取22.25 g β-環糊精，50 ℃水溶解，制成飽和溶液。精確稱取1 g紫蘇籽油和0.5 g無水乙醇(質量比2∶1)，混合均勻后加入β-環糊精過飽和溶液中，攪拌均勻后放置超聲波振蕩器中，于30、40、50、60、70 ℃條件下超聲70 min，每10 min取出磁力攪拌30 s；待冷卻后，放置冰箱(-18 ℃)冷凍20 h后進行脫包合。

1.3.4 脫包合過程

待凍干物融化后抽濾得白色固體，用無水乙醇20 mL洗滌2次，放入恒溫鼓風干燥器中，經2 h恒溫干燥(60 ℃)后，得到的白色粉末，即為β-環糊精-紫蘇籽油復合物；將復合物轉移至燒杯，加入50 mL石油醚，60 ℃磁力攪拌1 h后減壓抽濾，旋轉蒸發器(55 ℃)勻速旋轉蒸發回收石油醚，待回收完全后，剩余液體即為α-亞麻酸含量豐富的脂肪酸，用于檢測提取后的α-亞麻酸純度。

1.3.5 響應面試驗設計

選取Box-Behnken模型試驗設計，以料液比、超聲時間和超聲溫度為3個考察因素，分別以A、B、C表示，各因素設計3個水平，以-1、0、1對自變量的實驗水平編碼，共17組實驗，其中12組為析因點；5組為區域的中心零點。試驗設計因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素和水平

2 結果與分析

2.1 原料預處理

難溶或者微溶于水的物質需要借助乙醇、甲醇等有機溶劑才能溶解，從而更容易形成包合物[21]，而α-亞麻酸可溶于乙醇，因此可將原料加入乙醇充分混合后再加入環糊精包合溶液進行包合[22]。在超聲溫度50 ℃，超聲時間70 min條件下，分別稱取1 g紫蘇籽油FFA、1 g紫蘇籽油FFA和0.5 g無水乙醇(質量比2∶1)、1 g紫蘇籽油、1 g紫蘇籽油和0.5 g無水乙醇為原料，料液比為15∶1進行實驗。由圖1可知，當原料為混合脂肪酸和無水乙醇混合物、紫蘇籽油與無水乙醇的混合物時，α-亞麻酸純度相對較高，分別為73.17%和73.67%，且紫蘇籽油無需皂化、中和處理，工藝更加簡單，因此采用在紫蘇籽油中加入無水乙醇(紫蘇籽油∶無水乙醇=2∶1)的方式對原材料進行預處理。

注：FFA指經皂化、中和處理后所得紫蘇籽油混合脂肪酸。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 料液比對產物影響

在超聲溫度50 ℃，超聲時間70 min條件下進行實驗，由圖2可見，當料液比在10 ∶1～15∶1時，隨著β-環糊精用量的增加，紫蘇籽油中α-亞麻酸的提取率也逐漸升高。當料液比在15∶1時，紫蘇籽油包合完全，達到α-亞麻酸最大純度73.67%。當β-環糊精質量繼續增加時，α-亞麻酸純度開始降低，可能是紫蘇籽油包合完全后，再增加β-環糊精用量，會促使對混合溶液中未知雜質的包合，不僅增加了物料和成本的消耗，還降低了產物的純度。

2.2.2 超聲時間對產物影響

在超聲溫度50 ℃，料液比15∶1條件下進行實驗，由圖2可見，超聲波時間在50～70 min時，α-亞麻酸純度不斷增加，也即進入β-環糊精中空腔體的脂肪酸逐步遞增，70 min時，達到73.67%。80 min時α-亞麻酸純度開始降低，說明在包合完全后，如果繼續用超聲波振蕩，會導致脫包效應的產生，已被包合的紫蘇籽油會被振蕩出β-環糊精的中空腔體。

2.2.3 超聲溫度對產物影響

在超聲時間70 min，料液比15∶1條件下進行實驗，由圖2可見，α-亞麻酸純度有先增后減再增加的趨勢，但在趨勢變化上，α-亞麻酸純度增加趨勢沒有開始趨勢顯著，即在50 ℃條件下，達到α-亞麻酸最大純度73.67%，60 ℃后，紫蘇籽油無水乙醇混合液中的無水乙醇揮發量增加，溶解量下降，影響了包合物的形成，導致α-亞麻酸純度明顯下降。

圖2 料液比、超聲時間、超聲溫度對紫蘇籽油α-亞麻酸純度的影響

2.3 響應面實驗結果

2.3.1 回歸方程的建立與分析

根據Box-Behnken模型所設計的試驗方案進行響應面試驗，試驗設計與結果如表2所示。

表2 響應面試驗設計和結果

續表2

利用Design-Expert8.0.6軟件對表2數據進行響應面回歸分析，建立α-亞麻酸純度(Y)的回歸模型，擬合二次多項式方程如下：

Y=72.81+0.69A-0.96B+0.89C+1.34AB-0.48AC-0.35BC-1.67A2-2.70B2-2.07C2

各個因素的F值反映了此因素對試驗指標的重要程度，通過表3能夠得出，α-亞麻酸純度受3個因素的影響依次為B>C>A，即超聲時間>液料比>超聲溫度。模型二次項B2、C2均對響應值α-亞麻酸純度影響極顯著(P<0.01)；一次項B、二次項A2、AB交互作用顯著(P<0.05)；其余項對α-亞麻酸純度不顯著。剔除二次多項式中的不顯著項，將擬合方程修正為：Y=72.81-0.96B+1.34AB-1.67A2-2.70B2-2.07C2。

表3 回歸模型顯著性檢驗結果

2.3.2 響應面分析

圖3為各因素交互作用對α-亞麻酸純度影響的響應面與等高線圖。由圖3a可知，在液料比為15∶1的條件下，超聲溫度與超聲時間的交互作用較弱。當固定超聲溫度時，隨著超聲時間的延長，α-亞麻酸純度增大，但達到峰值后又呈下降趨勢。圖3b顯示，在超聲時間為70 min條件下，超聲溫度與液料比交互作用顯著，在液料比較小時，α-亞麻酸純度隨超聲溫度的增加而增加，達到峰值逐漸下降。由圖3c可知，在超聲溫度為50 ℃時，超聲時間和液料比的交互作用較弱。說明超聲時間對α-亞麻酸純度的影響與液料比的關系較小。

圖3 各因素交互作用對α-亞麻酸純度影響的響應面與等高線圖

通過Design-Expert 8.0.6軟件，并結合回歸模型和響應面圖分析得出提取紫蘇籽油α-亞麻酸的最佳條件為：超聲溫度51.12 ℃、超聲時間68.37 min、液料比15.54∶1。在此條件下，預測α-亞麻酸純度為73.02%。

2.3.3 驗證實驗

根據響應面分析所得最佳參數，綜合考慮實際情況，將工藝條件調整為超聲溫度51 ℃、超聲時間68 min、液料比15∶1，在此條件下重復3次，測得α-亞麻酸純度的平均值為72.93%，與模型預測值基本相符，證明此模型有效可靠。

3 結論

以紫蘇籽油為原料，在β-環糊精包合α-亞麻酸過程中，用超聲波振蕩取代普通的機械攪拌，雖然應用于工業化會有一定的局限性，但是利用超聲波釋放能量，更有利于包合物的形成，具有更廣闊的發展前景，并且用紫蘇籽油和無水乙醇直接進行環糊精包合，無需皂化處理，工藝簡單。實驗在單因素試驗的基礎上，利用Box-Behnken模型響應面分析優化，對提取紫蘇籽油中α-亞麻酸的工藝條件進行研究，得出了紫蘇籽油中α-亞麻酸提取的最佳工藝條件為：超聲溫度51 ℃、超聲時間68 min、液料比15∶1。本研究獲得了一種α-亞麻酸優化工藝，最優條件下α-亞麻酸純度可達到72.93%，可為后續α-亞麻酸進一步純化以及α-亞麻酸功能產品的開發提供思考。