基于FTIR技術快速測定食用油中叔丁基對苯醌含量的研究

(葉 沁 盧文靜 諶 迪 張 岑 肖朝耿 孟祥河

(浙江省農業科學院食品科學研究所1, 杭州 310021)

(浙江工業大學食品科學與工程學院2, 杭州 310014)

食用油在儲藏、熱加工過程中，受光照、高溫作用，同時可能曝露于氧氣、水分環境下，會發生水解、氧化、聚合、熱裂解等一系列反應，并且油脂與其他食物成分的相互作用常常同時發生，造成食用油的質量、營養降低，甚至帶來健康隱患[1]。叔丁基對苯二酚(TBHQ)，因其抗氧化效果好、成本低而被廣泛應用于延緩油脂氧化[2]。然而由于食用油長期暴露在高溫及有氧環境中，以及水分的存在會導致TBHQ自身發生氧化和降解。研究發現叔丁基對苯醌(TBBQ)是TBHQ氧化降解的主要產物[3]，且Li等[4]對比研究了大豆油在室溫下儲藏8 周以及120 ℃ 回流加熱24 h 后TBHQ 損失及TBBQ 的生成情況。結果發現熱處理過的食用油中TBBQ 的含量是非常小的(未給出具體數據)，其含量遠小于室溫下儲藏的食用油(約10 μg/mL)。前期研究發現當含有(204.89±1.63) mg/kg TBHQ的不同種類食用油在不同煎炸條件下油炸薯條時，在第1 批次到第5 批次煎炸后，煎炸油和油炸薯條中TBBQ殘留量均超過10 mg/kg[5]，表明不僅熱處理食用油中存在TBBQ，含油食品中同樣存在TBBQ風險。此外，有研究發現TBBQ的毒性明顯高于TBHQ[6]，且可致多種模式細胞發生凋亡現象[7，8]。因此亟需對添加TBHQ的食用油及外加含TBHQ的食用油食品中的TBBQ含量進行監測分析。然而目前食用油中TBBQ的分析仍借鑒TBHQ的分析方法[3，4]，存在前處理復雜、耗時長等缺點，尚沒有專用的檢測分析方法，難以實現準確快速、實時在線監測。

紅外光譜定量技術近年來發展迅速。因其分析快速、操作簡單，可實現樣品無損在線分析的特點，已廣泛應用在食品品質監測領域[9,10]。此外，紅外光譜技術通常結合化學計量學方法(如偏最小二乘法，PLS)組合使用，目前基于FTIR結合PLS法已構建了食用油中過氧化值[11]、碘價[12]、反式脂肪酸[13]、總極性化合物[14]和TBHQ[15]等快速檢測模型，所建模型的線性相關系數范圍為0.988 5～0.998 8，校正均方差為0.008 8～5.61，預測均方差為0.017～6.490。然而基于PLS法建模，需要大量的樣本量，樣品收集過程較為繁瑣。此外，基于特征吸收的朗伯比爾定律定量也是光譜中常用的定量方法，操作簡便，應用廣泛。其前提是待分析組分有明顯的特征吸收峰，且能夠與其他吸收基線分離。近年來已有研究者利用紅外光譜與朗伯比爾定律結合對食用油中的酸價[16]、磷脂含量[17]、微量水分[18]進行了快速測定，所建模型預測值與實際值的標準偏差在4.37%～8.21%范圍內。然而關于紅外光譜技術在測定食品中TBBQ含量的研究目前鮮有相關報道。

因此基于食用油及相關食品質量安全保障的需求，建立一個高效、快速、準確的TBBQ含量分析方法十分必要。本研究以大宗食用油代表精煉大豆油、菜籽油、葵花籽油和棕櫚油等為研究對象，對比研究FTIR結合朗伯比爾定律法和FTIR-PLS法快速定量分析TBBQ含量，以期對食用油及相關產品的質量安全控制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及樣品

TBBQ(純度≥98%)；色譜級乙腈、色譜級正己烷。葵花籽油、大豆油、菜籽油、調和油：市售，棕櫚油杭州市糧油檢測中心。

1.2 實驗儀器與設備

配有透射附件的Bruker Tensor 27傅里葉中紅外光譜儀(OPUS光譜分析軟件)，7890氣相色譜儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 TBBQ的GC法分析

食用油中TBBQ的測定方法參照美國分析化學協會TBHQ標準分析方法(AOAC Official method 983.15)。具體方法為：取2 g油至50 mL離心管中，加入10 mL乙腈飽和的正己烷溶液，反復搖勻后轉移至125 mL分液漏斗中，加入10 mL正己烷飽和的乙腈溶液中，劇烈振蕩，靜置至分層。收集下層至50 mL圓底燒瓶中。重復萃取2次，收集萃取液，旋蒸至近干，定容至10 mL，過0.45 μm膜，進行氣相分析。

GC條件：色譜柱HP-5 (30 m×0.25 mm×0.25 μm)，初始柱溫60 ℃，保持2 min，隨后以10 ℃/min升至250 ℃。氮氣流速1.5 mL/min，進樣口溫度280 ℃，進樣量1 μL，不分流。

1.3.2 紅外光譜(FTIR)法

1.3.2.1 樣品的準備

標準集樣品制備：準確稱取TBBQ(≥98%)標準品0.100 0 g于100 mL容量瓶中，色譜級乙腈溶解并定容，配制成1 000 μg/mL TBBQ-乙腈標準儲備液避光保存于4 ℃條件下。分別移取儲備液并稀釋至TBBQ的質量濃度分別為2、5、10、25、50、75、100、200 μg/mL。精確配制成總體積為5 mL的混合溶液，搖勻，靜置后備用。

預測集樣品制備：將TBBQ標準品分別按比例隨機溶于精煉葵花籽油、大豆油、花生油和菜籽油中，配置方法和比例同上。取2 g油樣用正己烷飽和的乙腈溶液萃取后，精確定容至5 mL得到的TBBQ乙腈溶液。

實際煎炸油樣品制備：取1.5 kg添加200 mg/kg TBHQ的大豆精煉油、菜籽油或棕櫚油置于恒溫煎炸鍋中，185 ℃下煎炸60 g預解凍的薯條，每批次煎炸3 min，每隔1 h煎炸1批，連續煎炸24批，以獲得不同TBBQ含量的不同種類的煎炸油。每批次煎炸結束后，取10 mL煎炸油冷卻至室溫，裝入棕色玻璃樣品瓶中于-80 ℃儲存用于后續TBBQ含量測定。TBBQ萃取方法同前述。

1.3.2.2 紅外光譜的采集

透射樣品的采集，CaF2樣品池用色譜純正己烷潤洗5遍后，用待測樣品潤洗3 遍，對TBBQ乙腈萃取液或樣品油上樣，采集FTIR光譜，每樣重復采集3次，以平均光譜記錄。OPUS軟件記錄4 000～400 cm-1的吸收光譜，分辨率為4 cm-1，掃描次數為32次，測量環境的濕度需小于70%，溫度保持在25 ℃。

1.3.2.3 模型建立

朗伯比爾定律法：分別取光譜級乙腈溶劑，采用 1 055 μm CaF2樣品池，記錄溶劑波譜S0，同時分別取質量濃度為2、5、10、25、50、75、100、200 μg/mL TBBQ乙腈溶液，記錄標準樣品的原始波譜S1系列。在模型優化過程中，做波譜減法運算即S1-S0，得到系列差譜S2。同時對波譜S1和差譜S2進行二階求導，并放大1 000倍，分別得到標準波譜的二階導數圖譜S1-2nd和差譜的二階導數圖譜S2-2nd。分別測量原始波譜S1、差譜S2、原始二階波譜S1-2nd和差譜二階S2-2nd相應特征峰吸收強度，將其與TBBQ濃度相關，得到乙腈中TBBQ濃度的標準曲線。

PLS法：采用TQ Analyst光譜分析軟件對所得紅外光譜進行二階導數，自動平滑等預處理及分析，優化模型。在光譜采集過程中，光譜噪聲會造成偏最小二乘法出現微小偏差，影響模型的穩定性。本實驗采集的光譜自動平滑以提高模型的穩定性，然后采用PLS模塊建模分析。

1.3.2.4 模型穩定性的驗證

對于所建的TBBQ朗伯比爾定律模型，隨機抽取煎炸后含有TBBQ的煎炸油，對比FTIR法TBBQ預測值與GC法標準值，計算相對誤差。

對于所建的TBBQ-PLS模型，需要對其穩定性進行驗證。將TBBQ隨機溶于大豆油、菜籽油和花生油，摻入比例隨機配制預測集樣品。計算相關系數(R2)，交叉驗證誤差均方根(RMSECV)、驗證均方差(RMSEC)、預測均方差(RMSEP)。

外部驗證獨立樣品分別為煎炸薯條不同時間后所得的大豆油、葵花籽油、棕櫚油、花生油，以及隨機選取的市售各類食用油。

1.4 數據處理

利用TQ Analyst光譜分析軟件進行定標模型的建立，建立導入的預測樣品根據建立的模型進行數學運算從而得出預測樣品的TBBQ的濃度，同時利用Origin 8.0進行分析。

2 結果與分析

2.1 FTIR結合朗伯比爾定律快速分析TBBQ含量

2.1.1 紅外光譜的分析

圖1 典型的TBBQ乙腈溶液紅外光譜圖

根據TBBQ的結構式，分別基于3 009、2 945、1 656 cm-1處進行朗伯比爾定律線性擬合，其所得的回歸方程和相關系數如表1所示。結果顯示，基于1 656 cm-1處所得的標準曲線效果最優，線性相關系數為0.977 9，故后續朗伯比爾建模波數采用1 656 cm-1。

表1 基于不同波數的標準曲線

2.1.2 基于不同波譜處理的TBBQ標準曲線的建立

由于樣品本身的物理性質、環境因素、儀器噪聲等因素會影響紅外光譜的采集，引起基線漂移和光譜重現性較差等問題，因此需要通過對波譜進行預處理來提高模型的準確度[20]。有研究表明，二階導數可有效降低波譜在采集過程中出現的漂移[10]，而差譜則可扣除溶劑基質吸收影響[18]。本實驗將對原始波譜分別進行差譜和差譜二階導數處理，TBBQ-乙腈溶液、差譜及差譜二階導數的波譜在1 640～1 660 cm-1波段內的局部放大圖如圖2所示，構建的線性回歸方程相關結果列于表2。基于差譜所構建的回歸方程的線性效果(R2=0.994 9)均明顯優于原始波譜(R2=0.977 9)，這可能是因為乙腈中微量水分(吸收峰1 630 cm-1)存在對TBBQ的特征吸收峰造成了一定的干擾。基于二階導數圖譜的回歸方程的線性關系(R2=0.998 1)優于差譜(R2=0.994 9)，這可能是因為二階導數可使峰銳化，利于峰拆分，此外還可部分消除基質吸收，因此表現出較高的分析精密度。二者均明顯優于TBBQ乙腈溶液原始紅外波譜回歸方程。最佳標準曲線為TBBQ(μg/mL)=108 9.5Abs-11.35。

表2 基于不同波譜處理的標準曲線

圖2 TBBQ-乙腈溶液(0～200 μg/mL)原始FTIR波譜、差譜及差譜二階導數波譜局部放大圖(1 640～1 660 cm-1)

2.2 TBBQ-朗伯比爾定律模型穩定性分析

基于不同波譜處理方法所得紅外光譜TBBQ特征峰的標準曲線穩定性分析結果如表3所示。不同波譜處理方法的所得TBBQ紅外預測值與化學值之間的相對誤差在1.22%～14.79%之間。從相對誤差的平均值看，基于差譜所構建的模型穩定性均略優于原始波譜所構建模型的穩定性；且經差譜-二階導數預處理組模型穩定性最佳，相對誤差范圍為1.22%～6.55%，相對誤差平均值僅為3.46%。楊志成等[18]采用溶劑萃取耦合FTIR技術結合朗伯比爾定律法分析了食用油中微量水分，同樣發現二階導數處理可以明顯改善模型的準確度。模型預測準確度后面將采用獨立實際煎炸油樣品和實際食用油樣品進行外部驗證，并結合PLS模型一起討論。

表3 基于不同波譜處理方法測定的TBBQ標準值與紅外預測值比較

2.3 基于FTIR結合PLS快速分析TBBQ含量

表4 基于中紅外透射光譜結合PLS在不同預處理方式及不同建模區間對TBBQ模型穩定性的影響

10組不同TBBQ濃度的精煉葵花籽油、大豆油、花生油、菜籽油樣品，采用原波譜最佳模型的預測結果與真實值的線性相關方程為Y=0.973 7X+0.005，相關系數R2=0.987 2，數據顯示FTIR-PLS模型TBBQ預測結果均與實際值高度符合，說明所構建的預測模型對TBBQ含量預測值和添加值一致性較好。Ammawath 等[15]基于TR-FTIR技術結合PLS法，在3 600～2 800 cm-1區間上構建了精煉棕櫚油中TBHQ含量的快速檢測模型。結果顯示其模型的相關系數R2為0.996 1，模型校正均方差為5.06，預測均方差為6.49。然而該模型并不適用于油脂中TBBQ的含量檢測。Li等[21]采用液相色譜技術構建了食用油中TBBQ含量的檢測方法，所建方法的回收率為96.28%～100.58%，相對標準偏差僅為0.30%～1.71%，該方法準確度較高。然而傳統化學法分析時間較長，難以實現快速、實時在線監測。

2.4 準確性實驗

隨機選取15組不同溫度下煎炸薯條1～24 h后的實際煎炸油樣品，分別采用標準GC法、朗伯比爾定律模型和PLS模型進行TBBQ含量測定，不同模型預測數據列于表5。其中朗伯比爾定律模型預測組的平均相對誤差4.89%；PLS預測組為8.53%。對比發現本研究所采用的FTIR結合朗伯比爾定律和FTIR結合PLS法所構建的TBBQ快速檢測模型均可用于煎炸油中TBBQ含量的快速測定，并且FTIR結合朗伯比爾定律法的準確性優于PLS法。

表5 準確性驗證結果

為了進一步驗證模型的穩定性和準確性，本實驗收集了市售的10種不同品牌不同類型的食用油作為外部驗證的樣品，分別用標準GC法、朗伯比爾定律模型和PLS模型進行TBBQ含量測定，不同模型預測數據列于表6。市售的10種食用油中TBBQ含量朗伯比爾定律模型和PLS模型預測組的平均相對誤差分別為6.80%和8.40%，表明本研究所構建的TBBQ快速檢測模型具有良好的預測能力，模型穩定性和準確度較好。因此本實驗所構建的FTIR快速分析煎炸油中TBBQ的方法可有望實現替代傳統化學分析法。

表6 基于不同模型預測10種市售食用油TBBQ含量

3 結論

建立了基于FTIR技術的食用油TBBQ快速測定方法，分析時間從傳統GC方法的2～3 h縮短到30 min。經分析比較發現，FTIR結合朗伯比爾定律法和FTIR結合PLS法均可用于食用油中TBBQ含量的快速測定。其中，FTIR結合朗伯比爾定律法所構建的模型穩定性和準確度明顯更好，該方法具有簡便、快速、準確、經濟等優點，適合于食用油品質的快速分析，這為逐步構建食用油在煎炸過程中的質量控制標準提供參考，同時對改善煎炸油及煎炸食品質量安全，保證消費者身體健康具有積極意義。