高粱蜀黍苷的研究進展

(吳 榮 牛江帥 巖溫香 程欣然牛庭莉 杜吉到 戴凌燕

(黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院1，大慶 230000)

(黑龍江八一農墾大學農學院2，大慶 230000)

高粱(禾本科)是一種耐旱谷物，即使在嚴重干旱脅迫下也能保持生長，由于其高度適應性，是半干旱地區重要的谷物和牧草作物[1，2]；是世界第五大主要谷類作物，就營養成分和能量價值而言，高粱可以作為玉米的替代作物，用于人類食物和牲畜飼料以及其他用途[1]。

高粱含有蜀黍苷( dhurrin) ，是一種生氰糖苷。蜀黍苷由L-酪氨酸經三種生物合成酶(兩種細胞色素P450，CYP79A1和CYP71E1酶以及UDP-糖基轉移酶，UGT85B1) 的作用衍生而來，編碼這3種酶的基因形成1個生物合成基因簇，在高粱基因組中彼此相鄰；還有1個轉運蛋白(multidrug and toxic compound extrusion，MATE) ，其作用是將潛在的自毒化合物隔離在植物細胞液泡中[3]。CYP79A1催化2個連續的N-羥基化反應，然后進行脫水和脫羧反應，在該反應中酪氨酸轉化為對羥基苯基-乙醛肟，然后將肟通過CYP71E1轉化為糖苷配基對羥基扁桃腈，隨后由可溶性UDPG-糖基轉移酶作用，生成蜀黍苷[4-7]。由于蜀黍苷生物合成涉及兩種膜錨定的細胞色素P450酶，因此發生在內質網( ER) 的胞質表面，由于苯環上羥基的電離而在非酸性環境中不穩定，它穩定地儲存在酸性液泡隔室中，但其從內質網向液泡的細胞內轉運機制尚不清楚[8]。蜀黍苷在高粱種子中沒有或較少，植株地上部的蜀黍苷含量比地下部高，葉片比莖高，且幼苗第一葉含量最高，葉片近軸端比遠軸端高；在種子整個發芽期基本保持不變，發芽種子和未發芽種子蜀黍苷含量幾乎沒差別，發芽后地上部、根部、整株幼苗蜀黍苷含量明顯增加[9-12]。不同酒廠釀酒高粱中都檢測到蜀黍苷，平均含量在4.52～19.82 mg/kg，其中粳高粱中蜀黍苷平均含量普遍高于糯高粱，且不同品種的釀酒高粱中蜀黍苷含量不同[13]。氰化物最小致死口服劑量為0.5～3.5 mg/kg，蜀黍苷本身沒有毒性，生氰植物被動物取食或者病原體侵染后，蜀黍苷與組織細胞內的β-葡萄糖苷酶和α-羥晴酶接觸后降解，釋放氰化氫和醛類化合物，氰化物與細胞色素C氧化酶的Fe3+結合，阻斷了呼吸鏈的最后一步，進而引起細胞中毒性缺氧癥，如心律紊亂、肌肉麻痹、呼吸窘迫等[14，15]。蜀黍苷還起著氮的儲存作用，可以通過循環途徑進行轉移，從而避免氰化氫的形成，并在特定的發育階段提供重要的還原氮來源[16，17]。酒精飲料Burukutu的不同品牌中，氰化物的含量從3.5～9.6 mg/kg，在復合面粉面包和啤酒中沒有檢測到氰化物[18]。因此，全面了解生氰糖苷生物合成途徑，對高粱中生氰糖苷進行風險評估，采取適當措施降低其含量具有重要的意義。

1 植物生氰糖苷的定量分析

通過液氮研磨或機械粉碎等方法處理植物樣品后，再經過物理和化學方法可將生氰糖苷提取出來，然后通過色譜法或比色法進行定量測定。

1.1 樣品的處理方法

常見的樣品處理方法有液氮研磨法和機械粉碎法。用液氮處理時，液氮溫度為-196 ℃，樣品組織變硬，脆性增加從而粉碎樣品；機械粉碎法是利用粉碎機對樣品進行粉碎，使樣品變為小塊、細粉或粉末。周韓玲等[19]研究表明，與機械粉碎法相比，液氮研磨法粉碎的高粱種子樣品提取液中蜀黍苷平均含量略高，但是穩定性極差，而機械粉碎法檢測值比液態氮研磨法低2.0%，說明機械粉碎過程中樣品的蜀黍苷水解性較差。孫紅等[20]也用機械粉碎法處理亞麻籽后測定其生氰糖苷的含量。液氮研磨法取樣量少，且成分不易被破壞或降解；但是研磨的樣品均勻性差，細度不一致，樣品在研磨、轉移過程中可能有一定損耗。同液氮研磨法相比，機械粉碎法較為穩定，重復性好，操作簡單、安全系數高、處理速度較快，且實驗成本較低。

1.2 含量測定

1.2.1 HPLC法

用液相色譜法測定植物中生氰糖苷含量的液相色譜條件為：色譜柱C18柱(100 mm×2.0 mm，3 μm)，柱溫30 ℃，流速0.2～2.0 mL/min，進樣體積1.0～5.0 μL；常用的流動相有乙腈、甲酸、水[21,22]；鄒良平等[23]通過HPLC測定各種木薯葉片中生氰糖苷的含量，結果表明，與國外所用木薯品種Mcol22相比，大部分木薯品種的生氰糖苷含量都較低，最低每克鮮重只有11.3 mg/kg。高效液相色譜檢測生氰糖苷的含量時還可以與質譜聯用。液質聯用以液相色譜作為分離系統，質譜為檢測系統，樣品經流動相被離子化后，經質譜的質量分析器將離子碎片按質量數分開，經檢測器得到質譜圖。質譜檢測方式有多離子反應檢測(MRM)和蒸發光散射檢測(ELSD)。劉錦儀等[24]用HPLC-ELSD 法檢測澳洲堅果果仁、花、葉、殼、青皮各部位生氰糖苷含量，結果發現花中生氰糖苷含量最高，達(49.92±0.96) mg/kg。高效液相色譜法直接測定植物中生氰糖苷含量，精度高。但是，該方法使用的生氰糖苷標準品非常昂貴，且在市場上不常見。

1.2.2 通過測定氫化勢(HCNp)計算含氰量

根據生氰糖苷可在-葡萄糖苷酶作用下生成氰化氫的原理，可以通過測定氰氫酸的含量進而間接計算出植物中生氰糖苷的含量。氰氫酸的檢測方法有硝酸銀滴定法和比色法。硝酸銀滴定法為國家標準所用方法，它適用于測量氰氫酸含量大于1 mg/kg的樣品[25]。用硝酸銀標準溶液滴定氰氫酸時，硝酸銀濃度通常選用0.02 mol/L，以碘化鉀做指示劑，銀離子先與氰氫酸根離子發生絡合反應，形成可溶性絡合物Ag(CN)2，到達終點時，多余的硝酸銀與碘離子反應生成渾濁沉淀，指示終點，以消耗硝酸銀的用量從而計算氫氰酸的含量。趙勝男[26]采用硝酸銀滴定法測定了亞麻餅中生氰糖苷含量為149.17 mg/kg。比色法主要有異煙酸—吡唑啉酮比色法、吡啶—巴比妥酸比色法和苦味酸比色法。異煙酸—吡唑啉酮比色法、吡啶—巴比妥酸比色法均在中性條件下，先由樣品中的氰化物與氯胺T反應生成氯化氰，然后采用不同的途徑生成有色物質進行比色。在異煙酸—吡唑啉酮比色法中，氯化氰與異煙酸作用，經水解后生成戊烯二醛，最后與吡唑啉酮縮合生成藍色染料，在638 nm波長測定吸光值[27]；在吡啶—巴比妥酸比色法中，氯化氰與吡啶反應生成戊烯二醛，戊烯二醛與兩個巴比妥酸分子結合生成紅紫色染料，在580 nm波長測定吸光值[28]。在苦味酸比色法中，氰氫酸在NaOH溶液中反應生成氰化鈉，氰化鈉再與苦味酸反應生成玫瑰紅色染料，于波長538 nm處測定吸光度[29]，Gleadow等[30]用苦味酸比色法測定生氰糖苷的含量。通過氫化勢間接測量生氰苷的方法簡單、快速、準確且相對便宜。

2 高粱蜀黍苷的代謝調控

高粱蜀黍苷的代謝過程受多種因素調控，盡管對其精細的調控機制還沒有十分的了解，但已有的研究成果為蜀黍苷的發酵工藝改進和菌種選育提供了思路和方法。蜀黍苷代謝相關酶、代謝途徑周圍微環境以及外源物質嚴格控制著蜀黍苷的代謝過程。了解高粱蜀黍苷的代謝調控，在高粱的轉基因技術、脫毒、以及其他的生理功能中都起著重要作用。

2.1 相關酶的調控

細胞色素P450 CYP79A1酶是蜀黍苷生物合成的關鍵酶，以水稻Act1啟動子為啟動子，反義克隆cyp79a1基因，用基因槍法轉化高粱品種CSV-15的莖段分生組織，獲得轉基因植株。轉基因高粱植株中HCN的生化檢測證實，轉基因植株及其后代中的HCN水平顯著降低[31]，這種方法被認為是可行和有效的，并且已經被證明可以減少木薯中的亞麻苦苷[32]。此外，這些高粱基因誘導氰苷產生的有效性已在擬南芥和煙草中得到證實[33]。反義技術可以大幅下調但不會完全阻斷靶基因[34，35]，對于高粱來說，cyp79a1基因是一個候選基因，因為它是蜀黍苷生物合成途徑中的第一個酶，而cyp79a1基因的下調會導致次生產物的不積累。Behrooz[36]等報告雙色高粱中的氰基葡萄糖苷的基因簇還包含一個基SbMATE2，該基因編碼稱為SbMATE2的MATE轉運蛋白和谷胱甘肽S - 轉移酶( GST) 的基因，與生物合成基因共表達。SbMATE2-YFP融合蛋白的瞬時表達和共聚焦顯微鏡實驗證明了SbMATE2在液泡膜上的定位。在非洲爪蟾卵母細胞中的轉運研究表明，SbMATE2能夠轉運蜀黍苷和非內源氰基葡萄糖苷。與CYP79A1共表達最高的基因是CYP71E1，其次是SbMATE2，此外，sbgst1和ugt85b1基因與CYP79A1共表達，這兩個基因彼此共表達水平最高。

水分限制使成年植株氰化物缺乏1類( acdc1) 突變體芽中的蜀黍苷濃度增加到與野生型植物相同的程度，并且未觀察到品系之間的生長優勢或劣勢。充分澆水后，突變體acdc1 葉片組織中較低的蜀黍苷濃度與突變體的芽和根中硝酸鹽含量的增加有關。這項研究發現植物年齡和水分限制是高粱中蜀黍苷濃度的最重要決定因素。在完全澆水的條件下，acdc1葉片組織中的蜀黍苷濃度較低，盡管水充足，隨著植物的成熟，HCNp下降，但蜀黍苷合成的仍在繼續，植物中總的蜀黍苷含量一直在增加直到最終收成為止[37]。Cecilia 等[38]使用針對性的基因組局部誘變( TILLING) 來鑒定具有突變的品系，該突變導致UGT85B1 N端區域提前終止密碼子。該突變的純合植物不產生蜀黍苷，命名為tcd2突變體( 完全缺乏氰化物2) 。它們的活力減弱、植株矮小、根系發育不良、生育力低下。使用LC-MS 進行分析顯示，tcd2突變體積累許多從蜀黍苷途徑衍生的代謝產物，其中一些與在表達cyp79a1和cyp79a1基因的擬南芥中觀察到的相似。結果表明，UGT85B1對于高粱中蜀黍苷的形成至關重要。

2.2 代謝途徑周圍微環境的調控

蜀黍苷代謝途徑周圍的微環境(如脂質膜)增加了蜀黍苷前體L - 酪氨酸向蜀黍苷的轉化，細胞溶質微環境已被提議用作蜀黍苷的穩定溶劑[39]。天然深共晶溶劑NADES由生物活體中常見代謝物組成，分析含有不同的NADES成分，以評估它們對生物合成酶的可能影響。在由葡萄糖：酒石酸和葡萄糖：蘋果酸組成的NADES濃度為5 %的情況下，觀察到膜相關代謝物最大活性，基于NADES的蜀黍苷生物合成酶在較高的溫度下都表現出較高的穩定性；在60 ℃下暴露30 min后，活性保持至少50%，這表明NADES可以提供一個惰性環境，防止蛋白質不可逆變性或抑制[40]。

Tomas等[41]通過在脂質體中體外重組蜀黍苷酶，研究UGT85B1對L - 酪氨酸向蜀黍苷轉化的影響，用不同比例的磷脂在脂質體中進行重組實驗，考察膜脂組成對蜀黍苷途徑細胞色素P450酶催化活性的影響。細胞色素CYP79A1酶活性受磷脂組成的影響較小；相反，CYP71E1酶的催化效率對脂質環境高度敏感。為研究植物中生氰糖苷途徑酶的組織結構，在煙草葉表皮細胞中瞬時表達生氰糖苷途徑酶以及它們的不同組合，結果證明CYP79A1和CYP71E1酶形成同質和異質低聚物，使胞質可溶性UGT85B1酶能夠募集。UGT85B1調節L - 酪氨酸的通量，刺激細胞色素CYPP79A1和CYPP71E1酶之間的通道，有效的新陳代謝通量和通道需要一個整體帶負電荷的脂質表面，并可能提供一種額外的手段來調節快速應對環境挑戰所需的動態組裝。

2.3 外源物質的調控

近年來，釀酒酵母已被證明是生產植物天然產品的有效宿主，如阿片類藥物嗎啡[42]、諾斯卡品[43]以及異長春花堿[44]。Kotopka等[45]通過在酵母中共表達蜀黍苷途徑酶和植物細胞色素P450還原酶來產生蜀黍苷，通過過量表達特定的宿主酶來增加前體酪氨酸的供應，從而進一步提高了蜀黍苷的產量。此外，他們還以蜀黍苷產生菌為平臺，研究雙色葡萄球菌基因組中蜀黍苷簇附近的一些酶的功能。結果表明，蜀黍苷通過天然酵母酶的過表達而顯著增加，并且擬南芥細胞色素P450還原酶能夠與酵母中的雙色鏈球菌P450酶偶聯以增加蜀黍苷的產生，這項工作表明，通常與蜀黍苷生產有關的酶類可以在酵母中功能性表達。在微生物宿主中測試這些基因簇的能力，沒有潛在的混淆植物酶活性，將是未來研究生氰糖苷生物合成的一個有價值的工具。

植物葉綠體是光驅動的細胞工廠，具有作為代謝工程應用底盤的巨大潛力。利用植物葉綠體，展示了光合還原力如何驅動代謝途徑來合成生物活性天然產物。為此，Gnanasekaran等[46]將雙色高粱的蜀黍苷途徑引進煙草的葉綠體中，通過將CYP79A1、CYP71E1和UGT85B1 整合到煙草葉綠體基因組的中性位點，將整個途徑引入葉綠體。兩個P450s和UGT85B1在葉綠體中表達時具有功能，并直接使用來自光合電子傳遞鏈的電子驅動將內源性酪氨酸轉化為蜀黍苷，而不需要存在NADPH依賴性的P450氧化還原酶，這一發現與先前的體外重組實驗[47]和瞬時表達研究[48]的結果一致。所獲得的結果為參與合成經濟上重要的化合物的植物P450s進入葉綠體的類囊體膜鋪平了道路，并證明它們的全部催化循環可以直接由光合作用產生的電子驅動。

3 高粱蜀黍苷可能的脫毒方法

在農產品中生氰糖苷的脫除常見的方法有物理化學法、生物發酵法和轉基因法；但是高粱中生氰糖苷的脫除目前沒有相關的研究，因此，參考其他農作物的脫除方法對指導降低高粱中蜀黍苷的含量具有重要的意義。

3.1 物理、化學法

氰苷一般味苦，易溶于水、乙醇；加熱使酶失活可阻礙氰苷分解產生有毒物質氰化氫。常見的物理化學方法有水煮法、蒸煮法、烘烤法、擠壓法和溶劑法。

水煮法的原理是根據生氰糖苷可溶于水的特性，隨著水溫連續增加，糖苷酶活性增加，生氰糖苷在糖苷酶的催化作用下溶解速率不斷增加，氰化氫的沸點相對較低被釋放出來，達到脫氰的效果，在80 ℃下可降低樣品中90%以上的生氰糖苷[49]。蒸煮法是在高溫、高壓下進行的，糖苷酶活性隨反應溫度的升高而升高，但超過一定的溫度則失活，此外，高壓也能使生氰糖苷的化學結構破壞，從而起到脫毒效果，在120 ℃的高壓滅菌鍋內蒸煮15 min可將氰苷完全去除[50]。烘烤法相對蒸煮法而言是在130 ℃、常壓干燥的條件下進行的，因此脫除效果沒有蒸煮法好，可使生氰糖苷降低10%～69%[51]；擠壓法是集混合、攪拌、破碎、加熱、蒸煮、殺菌、膨化及成型等為一體的高新技術，它具有高溫、高壓、短時強烈擠壓、剪切處理和熱處理的功能，擠壓法使樣品中生氰糖苷降低90%左右[52]。溶劑浸提法是利用相似相溶的原理，用甲醇或氨水等極性化學溶劑對生氰糖苷進行萃取，該方法可降低84%～89%[53]。綜上，在降低樣品生氰糖苷的物理化學方法中，蒸煮法的效果最好。

3.2 生物法

生物脫毒法是指篩選出能高產β-葡萄糖苷酶的微生物，或利用現代基因工程技術人工構建具有高效降解生氰糖苷特性的工程菌，使其在自身代謝活動中大量產生β-葡萄糖苷酶，進而去除農產品中的生氰糖苷。有研究者成功分離出一些能產生β - 葡萄糖苷酶的微生物，如乳酸菌、酵母菌、霉菌等[54]。喬琳等[55]從工業廢水中分離出一株能降解氰化物的細菌并探究了其最適降解條件，其粗酶液具有顯著降氰能力。Wu等[56]將人肝臟β - 葡萄糖苷酶基因和細菌氰化物水合酶基因一起導入酵母菌中構建工程菌，利用該菌產生的酶制劑對亞麻籽進行脫毒處理后發現，其生氰糖苷幾乎可以完全脫除。與物理和化學脫毒法相比，生物法脫毒具有作用條件溫和、安全高效等優點。

由于高粱是優質釀造白酒行業的主要原料，有效去除高粱中蜀黍苷具有重要意義。目前，在高粱釀酒過程中，通過高粱種子粉碎、蒸煮糊化和發酵等環節可以達到脫除蜀黍苷的效果。

3.3 轉基因法

簡單的加工只能去除部分氰苷，殘留部分仍可能對人體造成危害，并且加工過程對農產品品質造成一定的影響。轉基因技術可實現進一步去除有毒的氰苷，減少加工帶來的損失。目前，轉基因研究主要對象為木薯，通過抑制cyp79d1和cyp79d2基因的表達，以抑制氰苷的合成及增加羥腈分解酶的合成，加快氰苷的分解，最終減少木薯食用部位中的氰苷含量。具體方法有通過反義RNA和RNA干擾使基因沉默，導入外源性啟動子調節相關酶的合成。

4 展望

高粱含有豐富的營養成分，常用作釀酒的原料和飼料作物。高粱中的蜀黍苷是一種植物內源性毒素生氰糖苷，蜀黍苷與β -葡萄糖苷酶接觸會釋放有毒物質氰化氫，其存在對動物和人類造成嚴重危害。因此全面了解高粱中蜀黍苷的生物合成和降解途徑，識別分析生氰農產品的種植、貯運、加工及攝食等環節危害及其特性，采用不同的物理化學和生物方法去除蜀黍苷殘留物可以提高啤酒的品質，但是目前高粱脫毒的方法鮮有研究，后期可進一步研究有效的脫毒措施，為高粱中蜀黍苷的風險評價以及農產品質量安全監管提供參考。