腐殖酸對土霉素和土壤酶活性交互響應研究

權 剛,仝玉琴,高 瑩,張 潔,楊 迪

(咸陽職業技術學院,陜西 咸陽 712000)

土壤酶在土壤微生態活動中扮演重要角色，是土壤重要的有機組成成分之一，廣泛參與土壤中各類生物化學作用，具有生物催化能力，如動植物和微生物等殘骸的分解，土壤自身存在的腐殖酸的合成與生理作用等。土壤酶的生物活性反應了土壤生物化學過程的相對強度，如土壤過氧化氫酶、脲酶和磷酸酶全程參與土壤各類元素的生物化學反應及循環，屬于土壤新陳代謝過程中的催化劑。土壤酶的活性對土壤外源物的影響較為敏感，尤其是污染物，一定程度對土壤酶的生物活性具有破壞性，反之，土壤酶的活性也能夠反應土壤受到的污染情況。腐殖酸在農業上應用廣泛，它可以刺激農作物的生理代謝，改善農作產品籽實質量，改良土壤結構，優化化肥各種個性，增強植物自身抗逆性。

課題組擬模擬土霉素污染土壤環境，設計不同濃度梯度，通過測定8個周期內土壤中過氧化氫酶、脲酶、磷酸酶的生物活性，分析研究土霉素對土壤污染情況下，土壤酶的生物活性受到的影響情況，探明抗生素土霉素對土壤中微觀層面的生物效應，并嘗試使用腐殖酸對土壤生態環境進行修復，探索對處理農林業生產及生態環境問題的方案。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

腐殖酸，由凱瑞斯農業科技有限公司提供。

土霉素，購于美國默克公司，分子量496.9。

供試土壤，采自咸陽職業技術學院生物技術實習基地，0～20 cm表層土壤。

1.2 實驗方法

對采樣土壤作自然風干處理，風干過2 mm篩后常態保存，供室內培養實驗。試驗前，調節供試土樣含水量，按最大田間持水量40%為標準，裝塑封袋內，放置生化培養箱中，作暗箱培養一周，培養溫度25℃。

測定前，在土壤樣品中加入土霉素溶液，模擬抗生素污染土壤，配置土霉素濃度梯度為：0.02、0.035、0.065、0.113、0.201 mol OTC L-1，土霉素實際含量為10、17.8、32.6、56.2、100 mg OTC kg-1，并設置空白對照。

將試驗土樣稱取250 g加入燒杯中(500 mL)，用蒸餾水調節試驗土樣含水量為最大持水量的50%，放置恒溫培養箱中作暗箱培養，培養溫度25℃。為了更大程度模擬自然環境，培養期間，可用差減法補充水分，并適當通氣，保持土壤濕度與土壤活性。取培養時長第1天土樣進行測定，測定土壤中過氧化氫酶、磷酸酶和脲酶活性，后期按照每隔一周的時長，連續測定8周。

1.3 項目測定

1.3.1 過氧化氫酶 采用滴定法測定。將待測土樣過1 mm篩，用150 mL三角瓶稱取5 g，加入蒸餾水40 mL，0.3%過氧化氫5 mL。同時設置空白試驗，在150 mL三角瓶中注入等量蒸餾水和相同0.3%過氧化氫5 mL，但不加土樣。置于往返式搖床上，振蕩30 min，頻率120次·min-1。振蕩結束后，加入3N硫酸5 mL，待反應結束后，用致密濾紙過濾。取上層濾液25 mL進行滴定，用0.1N高錳酸鉀(0.02 mol·L-1當量)滴定至微紅色。

土壤過氧化氫酶的生物活性，用單位土重消耗的0.1 N高錳酸鉀毫升數與對照組試驗測定量的差表示。

1.3.2 脲酶 采用奈氏比色法測定。用250 mL帶塞三角瓶稱取5 g培養土樣,滴入甲苯(抑菌作用)1 mL, 靜置15 min使其充分反應, 再加入10%尿素溶液10 mL，pH6.7的檸檬酸鹽20 mL,作為緩沖液，用手搖勻后，在恒溫箱中培養，培養溫度設定37℃，培養時長24 h。培養結束后，取上層濾液并過濾,將濾液3 mL置于50 mL容量瓶中, 加入苯酚鈉溶液4 mL，0.9%次氯酸鈉溶液3 mL, 充分搖勻，待顯色20 min后, 用蒸餾水定容至50 mL。在分光光度計上578 nm波長比色測定。

土壤脲酶的生物活性，以培養24 h后每克土壤樣品中所含的NH3-N的毫克數來表示。

1.3.3 磷酸酶(堿性) 采用磷酸苯二鈉比色法測定。用稱50 mL三角瓶稱取待測土樣5 g，加入甲苯5滴，再加0.5%磷酸苯二納試劑20 mL，充分振蕩后進行恒溫培養，溫度設定37℃，培養時長2 h。培養結束后，取上層液進行過濾，吸取濾液5 mL置于50 mL容量瓶中，加入pH9.8氯化銨-氫氧化銨0.25 mL，作緩沖液用，加入2%的4-氨基安替比林液0.5 mL，8%鐵氰化鉀0.5 mL,用手充分搖動后，用蒸餾水定容至50 mL。在分光光度計上于510 nm處比色測定。

磷酸酶的生物活性，以培養2 h后，每百克土壤樣品中所含P2O5的毫克數來表示。

2 結果與分析

2.1 尿酶活性影響分析

土壤中的脲酶主要參與土壤氨氮的轉化及形成過程，土壤營養物質的吸收轉化過程，它的生物活性的高低反應了土壤的肥力水平，反之，也能夠反應土壤受到污染的程度。從表1可以看出，供試土樣第1天的測定結果顯示，土壤脲酶的生物活性受到明顯的抑制作用，土霉素濃度的越大，抑制作用越明顯。分別為：3.6%、5.2%、7.8%、7.7%、9.0%。供試土樣第7天的測定結果顯示，第1周開始土壤脲酶的生物活性受到土霉素的影響最大，抑制程度最高。分別達到：4.2%、10.0%、26.5%、23.7%、23.4%。供試土樣第14天的測定結果顯示，第2周開始土壤脲酶的生物活性受土霉素的影響有所減小，抑制的情況開始下降。抑制率分別為：8.5%、10.1%、0.6%、3.5%、4.3%。供試土樣第21天的測定結果顯示，第3周后土壤脲酶受土霉素影響相比略有下降，整天表現仍為抑制作用。抑制率分別為：3.7%、2.7%、9.9%、1.9%、1.6%。供試土樣第28天的測定結果顯示，從第4周以后土霉素對土壤脲酶的生物活性不在抑制，表現為刺激作用，第28天的刺激效果分別為：3.0%、0.1%、0.4%、5.0%、4.9%。供試土樣第56天的測定結果顯示，土霉素對土壤脲酶的生物活性的抑制作用已不再存在，各濃度都顯示刺激作用，刺激效果分別為：0.6%、4.9%、6.5%、4.0%、2.9%。由此可見，土霉素對土壤脲酶的生物活性的影響大致以第4周起程正太分布，前期主要表現為抑制脲酶生物活性，后期主要表現為刺激脲酶的生物活性。

表1 脲酶活性與土霉素濃度及培養時長試驗結果

2.2 磷酸酶活性影響分析

土壤磷酸酶對于磷在生態環境中的循環起著非常重要的作用，在研究污染物對土壤酶的影響中是研究頻率極高的一種酶。由表2可知，供試土樣第1天的測定結果顯示，土壤中磷酸酶的生物活性受到土霉素的刺激作用，尤其是最高濃度的土霉素對磷酸酶活性的刺激作用最強，達到了40.9%。供試土樣第7天的測定結果顯示，低濃度10 mg·kg-1、17.8 mg·kg-1兩個梯度的土霉素使土壤磷酸酶的生物活性受到抑制，而高濃度的土霉素則刺激磷酸酶的生物活性，濃度越高，刺激作用越強烈。供試土樣第14天的測定結果顯示，低濃度10 mg·kg-1、17.8 mg·kg-1、31.6 mg·kg-1處理的土霉素對土壤磷酸酶的生物活性產生抑制作用，而高濃度56.2和100 mg·kg-1的土霉素對土壤磷酸酶的生物活性產生刺激作用，但不論是抑制作用還是刺激作用對磷酸酶活性的影響都不顯著。到第21天所有處理下的磷酸酶活性均高于對照，其刺激情況與第3天情況相似。第28天的情況與14天相似。到56天所有土霉素處理磷酸酶活性均低于對照。土霉素對土壤磷酸酶活性的影響作用相對比較明顯，抑制或刺激程度相對較高，前4周表現為刺激土壤磷酸酶的生物活性，以后則表現為強烈的抑制作用。

表2 磷酸酶活性與土霉素濃度及培養時長試驗結果

2.3 過氧化氫酶活性影響分析

土壤過氧化氫酶是土壤植物微生物等進行呼吸作用，有機物生物化學氧化反應的關鍵參與者，它的存在，避免各生物反應過程中產生的過氧化氫對土壤及生物的危害作用，它的活性既表明土壤生物學特性，也能指示土壤污染狀況。從表3可知，供試土樣第1天、第7天的測定結果顯示，土霉素對土壤過氧化氫酶的生物活性有明顯的抑制作用，培養第1天和第7天抑制作用最強烈，且隨著土霉素濃度的增加土壤過氧化氫酶的生物活性降低越明顯。第1天的抑制率為：4.0%、5.3%、5.4%、6.5%、8.6%。第7天的抑制率為：2.6%、4.4%、5.9%、5.9%、7.0%。供試土樣第14天的測定結果顯示，第2周土壤過氧化氫酶的生物活性基本恢復到了空白對照水平。供試土樣第21天的測定結果顯示，從第3周起至培養結束，土壤過氧化氫酶的生物活性整體上都受到了抑制作用，但抑制作用不強烈，最高為3.3%。由此可見，各濃度梯度土霉素對土壤過氧化氫酶的生物活性影響較為明顯，整體表現為抑制作用，但抑制程度不強烈。

表3 過氧化氫酶活性與土霉素濃度及培養時長試驗結果

3 討論與結論

通過試驗表明，腐殖酸對土霉素污染的土壤酶活性具有一定的刺激作用。在實驗室控制條件下，通過模擬自然環境，測定了6個濃度梯度(含對照)土霉素對8周期內，土壤氧化氫酶、脲酶、磷酸酶活性的刺激與抑制情況。試驗表明，土霉素對脲酶活性的影響程正態分布，具體表現為前期抑制，后期刺激。初步原因分析與土壤中微生物的生長，土霉素碳、氮源形式使得脲酶活性后期被激活恢復有關；對土壤磷酸酶表現較為復雜且持續時間較長，僅在第1天、第21天各濃度均表現為刺激作用，其余均表現為抑制作用；對土壤過氧化氫酶活性抑制作用較為明顯，并隨時間推移，抑制作用減弱。

研究表明，腐殖酸含有多種活性官能團，可以強化作物體內過氧化氫酶的活性，刺激植物生理代謝，具有催芽、增根等功能，能夠刺激根系細胞組織分裂增長，促使植物根量增加，為植物生長提供充足的養分。腐殖酸與土壤中的微量元素能夠形成促進植物子實生長的絡合物以及螯合物，加強植物根系對糖分、淀粉、蛋白質及各種維生素的合成運轉，加速各種初級產物在子實中轉化積累。腐殖酸能夠增強土壤團粒結構的形成，促進土壤中好氧細菌的活性，加快對有機質等營養物質的分解轉化，提高植物對營養的吸收。腐殖酸中的羥基、酚基等官能團，能與有機化肥更好的作用，可以抑制土壤脲酶的活性，促進根系對磷元素的吸收利用，有利于根系和葉面吸收微量元素。腐殖酸有固液兩相，表面活性交大，可增強植物抗旱、保水性，進而通過改變細胞膜滲透性等作用，提高植物吸收養分，減少病蟲害。

關于腐殖酸在改良土壤環境及對修復抗生素污染土壤環境等方面的作用，我們認為具有很高的價值，在深入探索其影響機制及改良效果等方面亦將是課題組未來研究的主要方向，相關試驗將在后期課題中繼續開展。