‘鄂馬鈴薯3號’對干旱脅迫早期響應的轉錄組分析

劉圣宣，程云霞，劉騰飛*，宋波濤

（1.農業農村部馬鈴薯生物學與生物技術重點實驗室/湖北馬鈴暮工程技術研究中心/華中農業大學，湖北 武漢 430070；2.塔里木大學植物科學學院，新疆 阿拉爾 843300）

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是繼水稻、玉米和小麥之后，全球第四大糧食作物，為保障全球糧食安全以及滿足未來人口增長對糧食的進一步需求等方面起著重要作用。馬鈴薯也是中國第四大農作物，因其具有高產、耐貧瘠、抗逆性強、經濟效益高及產業鏈長等優點，從而成為貧困地區的主要糧食作物。此外，在不擠占糧食作物用地的前提下，通過種植馬鈴薯能有效擴充糧食供給，保障國家糧食安全。中國馬鈴薯年種植面積及總產量均居世界首位，種植面積和產量分別占全球的27.38%和24.53%[1]，但是就馬鈴薯平均單產而言，中國是偏低的，甚至不及世界平均水平。由此可見，中國馬鈴薯的單產水平仍有很大的提升空間，而提高馬鈴薯單產水平的策略之一是選育優良品種。

干旱脅迫是制約作物產量的重要因素之一，不僅造成作物減產，甚至導致作物絕收。統計數據顯示，由干旱引起的糧食減產率平均高達10.1%，是威脅糧食生產的最嚴重極端氣候災害[2]。作為干旱敏感作物，馬鈴薯的生長發育和產量的形成均受到干旱的嚴重威脅，其種植面積的擴大也受到干旱因素的限制[3]。因而，選育具有干旱抗性的新品種對于馬鈴薯產業的可持續發展有著積極意義。

由于固著生長的屬性，植物在整個生命周期中需要應對各種不同脅迫的挑戰，因而進化出了強大的環境適應能力。植物細胞通過改變細胞膨壓或是膜受體活性來識別環境脅迫。隨后胞外信號通過第二信使傳遞轉化為胞內信號激活下游信號轉導途徑，啟動逆境下的轉錄調控，從而積累脅迫相關的蛋白和代謝物應對逆境[4]。植物響應干旱脅迫的轉錄調控主要由脫落酸（Abscisic acid，ABA）依賴和非ABA 依賴兩種途徑實現。其中ABA 響應元件（ABA-responsive element，ABRE）和轉錄因子ABRE-binding protein/ABRE-binding factors（AREB/ABFs）在 ABA 依賴途徑的基因表達調控中起關鍵作用，與之類似干旱響應元件（Dehydration-responsive element/C-repeat， DRE/CRT）和轉錄因子Dehydration responsive element binding（DREB）factors 在非ABA 依賴途徑的基因表達調控中起關鍵作用[4]。

由于馬鈴薯根系淺并且稀疏的特征，大多數栽培種對干旱脅迫較為敏感，水分缺乏能抑制甚至完全停止馬鈴薯許多生理過程，如光合作用、呼吸作用和胞內的酶促反應[5]，甚至短時間的干旱脅迫都能嚴重危害馬鈴薯的正常生長發育，最終影響塊莖產量和品質[6]。由于同源四倍體栽培種馬鈴薯遺傳背景復雜的特征，相較于其他作物，對馬鈴薯抗旱性研究機制嚴重滯后。近些年，利用RNA-seq 或Microarray 技術，多項研究對馬鈴薯干旱脅迫下的轉錄調控進行了分析[7-14]，結果顯示多種信號通路和代謝通路參與了馬鈴薯對干旱脅迫的響應，如ABA 途徑、活性氧（Reactive oxygen species，ROS）清除、胚胎發育晚期富集蛋白（Late embryogenesis abundant，LEA）和熱激蛋白的累積，碳水化合物代謝和氨基酸代謝途徑。然而，研究極少針對馬鈴薯干旱脅迫早期的響應特征進行探究。基于此本研究利用栽培品種‘鄂馬鈴薯3 號’組培苗通過短時間干旱脅迫處理，通過形態觀察，含水率變化測定及轉錄組分析以揭示馬鈴薯應對干旱脅迫的早期響應特征，為馬鈴薯抗旱性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗所用的馬鈴薯材料為栽培品種‘鄂馬鈴薯3 號’（Solanum tuberosum cv. E3）。馬鈴薯試管苗培養于農業農村部馬鈴薯生物學及生物技術重點實驗室的培養室，培養室溫度設定為20℃，光照設定為（16 h 光照/8 h 黑暗），光照強度為400～600 μmol/m2·s。

1.2 材料處理

將‘鄂馬鈴薯3 號’試管苗在4%蔗糖的MS 培養基生長2 周后用于試管苗的干旱處理，處理方法為將試管苗整株拔出，放在吸水紙上置于環境控制良好的培養室中（溫度為20℃，濕度為50%）進行模擬干旱早期脅迫處理。分別在處理0，1 和6 h 進行整株取樣，每5 株作為一個重復，每個時間點取3 次重復進行后續表型及含水量分析和RNA 抽提。

1.3 含水量測定

取樣后立即對每個樣本進行稱重，質量記為M1。然后將樣品放入恒溫干燥箱，烘干至恒重后，質量記為M2。含水量（%）=（M1 - M2）/M1 ×100，而后將結果導入GraphPad Prism 9 統計軟件進行繪圖及統計分析。統計分析采用GraphPad Prism 9 內置的One-way ANOVA 多重比較方法。

1.4 RNA抽提、文庫構建和轉錄組分析

將上述樣品在液氮中研磨成粉末，利用植物總RNA 提取試劑盒（RN33，艾德萊，中國）進行抽提，具體操作步驟嚴格按照說明書進行。每個樣品取約2 μg RNA 用于文庫構建。文庫構建及測序委托北京貝瑞和康生物技術有限公司完成。獲得的clean data 利用Salmon v.1.4.0 以DM1-3 v6.1（http://spuddb.uga.edu/dm_v6_1_download.shtml）轉錄本注釋作為參考，參數設置為默認對轉錄本進行量化[15,16]。隨后將Salmon 輸出的數據導入R 包DESeq2[17]，進一步進行差異表達分析。差異基因篩選的閾值為FDR ＜0.01, log2（fold change）＞1。

2 結果與分析

2.1 ‘鄂馬鈴薯3 號’試管苗干旱處理過程中的表型及含水量變化

分別對‘鄂馬鈴薯3 號’試管苗不同干旱處理時間后的表型進行觀察，結果如圖1A 所示。干旱處理0 h 時，‘鄂馬鈴薯3 號’試管苗表現正常，在干旱處理1 h 后出現了微弱的萎蔫現象，而當干旱處理6 h 后‘鄂馬鈴薯3 號’試管苗葉片出現了明顯的萎蔫，說明此時馬鈴薯已經出現了干旱脅迫。隨后進一步對不同處理時間馬鈴薯葉片的含水量進行了測定，測定結果如圖1B 所示。與表型觀察結果相一致，‘鄂馬鈴薯3 號’試管苗在干旱處理0 h 時含水量最高，在處理1 h 后顯著降低，而處理6 h 后含水量進一步降低。上述結果表明，隨著干旱處理時間的延長，‘鄂馬鈴薯3號’試管苗受脅迫的程度逐步加深。

圖1 馬鈴薯干旱脅迫處理不同時間點的表型及含水量分析Figure 1 Phenotype and water content analysis of potato at different time points under drought stress

2.2 ‘鄂馬鈴薯3 號’試管苗干旱處理過程中轉錄組分析

為了揭示‘鄂馬鈴薯3 號’試管苗干旱處理過程中的轉錄變化，分別取上述干旱處理時間點的試管苗進行RNA 抽提和轉錄組測序分析。每個時間點取3 個重復，3 個時間點總共構建并測序了9 個轉錄組文庫。測序獲得的原始reads 比對到最新注釋的DM1-3 轉錄本上，并將比對到多個轉錄本的reads 進行了剔除。主成分分析（Principal component analysis，PCA）顯示，‘鄂馬鈴薯3 號’試管苗干旱處理過程中各個時間點上的重復性較好，并且不同時間點間出現明顯分離（圖2），說明不同時間點間樣品的整體轉錄差異較大。

圖2 不同干旱處理時間點的轉錄組數據主成分分析（PCA）Figure 2 Principal component analysis (PAC) for RNA-seq data at different time points under drought stress

2.3 ‘鄂馬鈴薯3 號’試管苗干旱處理過程中不同時間點的基因差異表達分析

為了鑒定‘鄂馬鈴薯3 號’試管苗干旱處理過程中不同時間點的差異表達基因（Differentially expressed genes，DEGs），分別對這3 個時間點進行了兩兩比較，差異基因的閾值設置為FDR ＜0.01，差異表達倍數超過2，結果如圖3所示。1 h vs 0 h、6 h vs 0 h 及 6 h vs 1 h 分別鑒定到 5 315、9 728 和8 606 個差異表達基因，說明隨著處理時間的延長，差異基因的數量也進一步增加。其中1 h vs 0 h 和 6 h vs 0 h 共同差異基因為 3 424 個，而所有不同處理間的共有差異基因為1 576 個。

圖3 維恩圖分析不同干旱處理時間點間的差異基因集Figure 3 Venn diagram analysis of DEG sets among different comparison groups

2.4 ‘鄂馬鈴薯3 號’試管苗干旱處理過程中不同時間點的top差異基因熱圖及注釋分析

為了揭示每個干旱處理時間點表達差異最大的部分基因，分別在1 h vs 0 h、6 h vs 0 h 及6 h vs 1 h 的差異基因中各選取了10 個上調和下調最為劇烈的基因。去除冗余后一共獲得了52 個差異基因，熱圖聚類及注釋如圖4 所示。這些基因明顯的可以聚為三大類，其中第一類是在處理0 h 時高表達，第二類則為處理6 h 時高表達，第三類為處理1 h 時高表達。其中Soltu.DM.03G035590.1和Soltu.DM.01G031660.1 分別編碼兩個轉錄因子GATA transcription factor 和Plant-specific transcription factor YABBY family protein，他們的表達量在干旱處理6 h 后極顯著降低，暗示其可能為馬鈴薯干旱調控的負向因子。在6 h 特異高表達的基因中，包含3 個LEA，而LEA 蛋白被認為是一類干旱脅迫誘導蛋白。此外一個MYB 類的轉錄因子也在干旱處理6 h 特異高表達，暗示其可能是一個干旱特異誘導的轉錄因子，可能正向調控馬鈴薯的抗旱性。

圖4 熱圖分析不同比較組中的上調和下調差異基因TOP10Figure 4 TOP10 up-regulated and down-regulated DEGs as illustrated in heatmap among different comparison groups

2.5 ABA信號途徑的相關組分在干旱誘導過程中的表達模式分析

ABA 信號途徑被認為是在干旱脅迫過程中起重要作用，根據已發表的文獻，分別對已知的參與ABA 途徑重要的激酶SnRK2s 家族成員及其下游AREB/ABF/ABI5 類轉錄因子在馬鈴薯干旱處理過程中的差異變化進行了探究，結果如表 1 所 示 。 8 個 StSnRK2s 和 7 個 AREB/ABF/ABI5s在1 h vs 0 h 組合中，6 個出現了2 倍以上的表達差異，其中上下調最為劇烈的分別是StSnRK2.1和StABL2。在6 h vs 0 h 組合中，除StSnRK2.2、StSnRK2.5、StABL1 和StABL2，其他基因均出現了兩倍以上的上調表達，說明這些ABA 信號途徑的相關基因均能受到干旱脅迫的誘導。7 個AREB/ABF/ABI5s 轉錄因子成員中，StAREB1、StAREB2 和StAREB4 的表達量明顯高于其他4個，以StAREB2 的表達量最高，并且在干旱處理過程中的上調最為劇烈，暗示StAREB2 可能是參與干旱脅迫過程中的重要轉錄因子。而StSnRK2.4 和StSnRK2.8 則為馬鈴薯干旱脅迫過程中高表達的激酶，且其表達在干旱處理6 h 后均出現超過兩倍的上調表達，表明StSnRK2.4 和StSnRK2.8 可能是響應干旱脅迫過程中的重要蛋白激酶。

表1 馬鈴薯ABA信號途徑部分基因在不同比較組的表達差異分析Table 1 Differential expression analysis of potato ABA signal pathway-related genes among different comparison groups

3 討 論

馬鈴薯通常被認為是干旱敏感性作物，由全球氣候變化引起的干旱頻發嚴重威脅了馬鈴薯的可持續生產。許多研究通過探究馬鈴薯耐旱性的生理、生化和遺傳基礎，試圖保證馬鈴薯在干旱脅迫下的產量。馬鈴薯對干旱的復雜表型反應受其基因型、發育階段和環境的相互作用影響。因此利用生長條件受到嚴格控制的組培苗作為材料可以消除一定的干擾。破譯馬鈴薯的干旱應答機制，解析馬鈴薯干旱應答的核心因子，通過現代基因編輯等手段對這些核心因子進行編輯，實現馬鈴薯抗旱性的增強對于破解因干旱導致的馬鈴薯種植限制有著巨大的潛在意義。基于此，本研究以普通馬鈴薯栽培種為材料，對馬鈴薯應對干旱的早期響應機制進行了探究。本研究發現利用組培苗為材料可以使得馬鈴薯在6 h 時即出現明顯的干旱脅迫表型（圖1），為研究馬鈴薯的干旱脅迫早期響應提供了參考。

此外本研究還利用高通量轉錄組測序對馬鈴薯干旱脅迫早期不同時間進行了轉錄分析。與前人研究結果類似，馬鈴薯在應對干旱脅迫時能通過大量的轉錄調控以適應環境，本研究發現在干旱處理1 及6 h 時，出現兩倍差異的基因分別高達5 315 和 9 728 個（圖 3）。進一步對 TOP10 差異上調和下調基因分析發現，兩個轉錄因子GATA transcription factor 和Plant-specific transcription factor YABBY family protein 的表達受到干旱的顯著抑制（圖4），可作為后續目標進行功能驗證。此外與前人結果類似，鑒定到3 個受干旱誘導的LEA 蛋白[18,19]，其在干旱處理6 h 后高豐度累積，可能是潛在的干旱誘導Marker 基因。MYB 類的轉錄因子在馬鈴薯干旱脅迫過程中起重要作用，過表達MYB 轉錄因子StMYB1R-1 能增強馬鈴薯抗旱性[20]。本研究同樣鑒定到一個MYB domain 蛋白在干旱處理6 h 特異高表達，后續研究也可以通過穩定遺傳轉化探究其在馬鈴薯干旱脅迫中的功能。

ABA 在調控植物非生物脅迫方面起著重要作用，Liu 等[21]研究發現，ABA 能調控馬鈴薯在應對土壤逐步干旱過程中的氣孔和光合水分利用效率。Gong 等[8]和 Chen 等[19]通過對馬鈴薯應對干旱脅迫下的轉錄組分析，結果均表明干旱脅迫會誘導ABA 信號通路上相關基因的表達。Bai 等[22]在全基因組水平對馬鈴薯SnRK2s 進行了鑒定和表達模式分析，結果顯示馬鈴薯基因組中存在8 個SnRK2s 成員，部分成員可能參與馬鈴薯對脅迫的響應。全基因組范圍內的序列鑒定和分析發現，馬鈴薯基因組中有7 個AREB/ABF/ABI5 亞家族成員，其中部分成員能同時響應ABA 和非生物脅迫處理[23]。在此研究中重點探究了這些StSnRK2s 和StAREB/ABF/ABI5s 的表達差異，再次驗證蛋白激酶 StSnRK2.4 和 StSnRK2.8 以 及 轉 錄 因 子StAREB2 可能是ABA 信號通路上響應干旱脅迫過程中的重要組分（表1）。對于這些基因的進一步深入研究將有利于揭示ABA 信號途徑在馬鈴薯干旱脅迫中的重要功能。后續研究通過深入挖掘上述可能的馬鈴薯應答干旱脅迫的重要基因，解析其作用機制，將有利于加速抗旱種質資源的篩選和抗旱品種的選育進程，對于科學推進中國馬鈴薯主糧化和主食化產業發展戰略具有極其重要的現實意義。