羥基喜樹堿納米粒在大鼠體內的藥動學、組織分布及靶向性研究

林柳任 竇晨 鄭永仁 馬云淑 孫赟 程欣

摘 要 目的：研究羥基喜樹堿納米粒在大鼠體內的藥動學及組織分布特征，并探討其靶向性。方法：將雄性SD大鼠隨機分為兩組，每組6只，分別單劑量尾靜脈注射羥基喜樹堿納米粒和市售羥喜樹堿注射液（4 mg/kg，以羥基喜樹堿計），在給藥后5、30、60、120、240、360、480、600、720 min時于眼底靜脈叢取血500 μL，采用高效液相色譜法測定不同時間點血漿中羥基喜樹堿的含量，以DAS 3.0等軟件計算藥動學參數。另取雄性SD大鼠隨機分為兩組，每組24只，分別單劑量尾靜脈注射羥基喜樹堿納米粒和市售羥喜樹堿注射液（0.6 mg/kg，以羥基喜樹堿計），在給藥后30、60、120、240 min時于腹主動脈取血并摘取心、肝、脾、肺、腎、腦，采用高效液相色譜法測定不同時間點血漿及組織中羥基喜樹堿的含量，考察其分布特征及靶向性。結果：羥基喜樹堿納米粒和市售羥喜樹堿注射液在大鼠體內均符合二室模型，羥基喜樹堿納米粒的AUC0-720 min和AUC0-∞分別為市售羥喜樹堿注射液的1.89和1.87倍，MRT0-720 min和MRT0-∞為2.74和3.00倍，t1/2β為2.75倍，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）;給藥后30 min時，羥基喜樹堿納米粒和注射液在肺中濃度最高;隨著時間的推移，藥物逐漸向肝部位積累，在60 min時肝藥濃度達到最高。羥基喜樹堿納米粒在肝的相對攝取率最大（6.28）;以肝為靶向器官，其在心、脾、肺、腎、腦和血漿中的靶向效率均大于羥喜樹堿注射液;給藥后30～120 min，羥基喜樹堿納米粒在心、肺（除給藥后30 min外）、腎、腦、血漿中的選擇性指數均顯著高于羥喜樹堿注射液（P<0.05或P<0.01）。結論：羥基喜樹堿納米粒延長了藥物的半衰期、提高了其血藥濃度、延長了其體內作用時間，且肝靶向性顯著。

關鍵詞 羥基喜樹堿;納米粒;藥動學;組織分布;靶向性;大鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE：To study the pharmacokinetics and tissue distribution characteristics of Hydroxycamptothecin （HCPT） nanoparticles in rats， and to investigate their targeting. METHODS： Male SD rats were randomly divided into 2 groups， with 6 rats in each group. They were given HCPT nanoparticles and HCPT injection （4 mg/kg based on HCPT） via tail vein respectively. 500? μL fundus venous plexus blood were sampled at 5， 30， 60， 120， 240， 360， 480， 600 and 720 min after administration. The plasma concentration of HCPT in rats were measured by HPLC at different time points. The pharmacokinetic parameters were calculated by DAS 3.0 software. Male SD rats were randomly divided into two groups， with 24 rats in each group. They were given HCPT nanoparticles and HCPT injection （0.6 mg/kg based on HCPT） via tail vein， respectively. Blood was immediately taken from the abdominal aorta， and heart， liver， spleen， lung， kidney and brain were removed at 30， 60，120， 240 min after administration. The plasma and tissue concentration of HCPT in rats were measured by HPLC. The distribution of HCPT in each tissue and targeting were investigated. RESULTS： HCPT nanoparticles and its injection conformed to a two-compartment model in rats. Compared with HCPT injection， AUC0-720 min and AUC0-∞ increased by 1.89 and 1.87 times respectively，? MRT0-720 min and MRT0-∞ increased by 2.74 and 3.00 times respectively， t1/2β increased by 2.75 times， with statistical significance （P<0.05）. At 30 min after administration， HCPT nanoparticles and HCPT injection had the highest concentration in lung; with the passage of time， the drug gradually accumulated in the liver and reached the highest concentration at 60 min. The relative liver uptake rate of HCPT nanoparticles was the highest （6.28）.? Taking liver ad target organ， and the targeting efficiencies of it in heart， spleen， lung， kindey， brain and plasma were higher than those of HCPT injection. The selectivity index of HCPT nanoparticles in heart， lung （except for 30 min after administration）， kidney， brain and plasma were significantly higher than those of HCPT injection at 30-120 min after administration. CONCLUSIONS： HCPT nanoparticles extend the half-life of the drug， increase its plasma concentration， and prolong its action time in vivo， with significant liver targeting.

KEYWORDS? ?Hydroxycamptothecin; Nanoparticles; Pharmacokinetics; Organization distribution; Targeting; Rat

中圖分類號 R917 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）02-0164-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.02.07

羥基喜樹堿（Hydroxycamptothecin）是一種具有高效抗癌作用的活性生物堿，臨床上常用以輔助治療各類原發性肝癌、胃癌、食道癌等惡性腫瘤[1-3]。羥基喜樹堿在堿性環境中易開環生成溶于水的羧酸衍生物，故臨床上多以此衍生物的鈉鹽作為注射液使用[4]。但因羥基喜樹堿開環衍生物的生物利用度低、半衰期短，在體內吸收慢且毒副作用大，其臨床應用上受到了很大的限制[5]。近年來，納米粒的應用越來越廣泛，其作為藥物載體，具有制備工藝簡單、保護藥物不被降解、促進藥物吸收、優化并改善藥物在體內的分布特征等優點[6]。基于此，本課題組前期成功制備了羥基喜樹堿納米粒。為進一步探討其體內的緩釋作用及靶向性，本研究以市售羥喜樹堿注射液為參照，比較了羥基喜樹堿納米粒在大鼠體內的藥動學及組織分布特征，旨在為該制劑的臨床應用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

實驗所用儀器有：Waters e2695型高效液相色譜（HPLC）儀（包括2998型二極管陣列檢測器、717型自動進樣器、1525型元梯度輸液泵，美國Waters公司）、190 Plus PALS型納米激光粒度儀（美國Brookhaven Instruments公司）、TGL-16G型臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）、FS-300N型超聲波處理器（上海生析超聲儀器有限公司）、DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予化儀器有限責任公司）、XK96-A型快速混勻機（江蘇新康醫療器械有限公司）、XHF-1型高速分散器（寧波新芝生物科技有限公司）、CP124C-OHAUS型電子天平（奧豪斯儀器常州有限公司）、HSC-12A型氮吹儀（天津市恒奧科技發展有限公司）。

1.2 藥品與試劑

實驗所用藥品和試劑有：羥基喜樹堿對照品（彭州茂源生物科技公司，批號170401，純度≥99%）、喜樹堿對照品（內標，成都得思特生物技術有限公司，批號DST180310-028，純度≥98%）、羥喜樹堿注射液（哈爾濱三聯藥業股份有限公司，批號19010510，規格10 mL ∶ 10 mg）、聚乳酸-羥基乙酸-聚乙二醇-葉酸（PLGA-PEG-FA，分子量18.5 kDa，重慶浦諾維生物科技有限公司）、聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA，分子量13 kDa，濟南岱罡生物科技有限公司）、全氟戊烷（PFP，美國Strem Chemicals公司）、細胞膜熒光探針DiR碘化物（美國Biotium公司）、聚乙烯醇（PVA，分子量89～98 kDa，水解度99%，美國Sigma公司）、二甲基亞砜（DMSO，廣州賽國生物技有限公司，純度≥99%）、肝素鈉注射液（常州千紅生化制藥股份有限公司，批號151903017A，規格2 mL ∶ 5 000 U）等;甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純或實驗室常用規格，水為純凈水。

1.3 動物

SPF級SD大鼠，雄性，體質量（250±20）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產許可證號為SCXK（湘）2019-0004。所有大鼠均常規飼養于云南中醫藥大學實驗動物中心。

2 方法與結果

2.1 羥基喜樹堿納米粒的制備

精密稱取羥基喜樹堿對照品約63 mg，溶于DMSO 1.5 mL中，超聲（功率480 W，頻率40 kHz）處理30 min，即得質量濃度為42 mg/mL的羥基喜樹堿混懸液;在該混懸液中加入PLGA 25 mg、5 mg/mL DiR碘化物溶液（溶劑為乙酸乙酯）0.1 mL，作為油相1（O1）。吸取PFP 300 μL，加入至O1相中，于避光冰浴下超聲（功率105 W，頻率25 kHz，下同）乳化366 s，得到乳化后的油相1′（O1′）。另稱取PLGA-PEG-FA 75 mg，溶于乙酸乙酯0.5 mL中作為油相2（O2）。將O2相加入到O1′相中，于避光冰浴下超聲乳化10 s，得到O1′/O2初乳;將上述初乳加入到5 mg/mL PVA水溶液[水相（W）]中，于避光冰浴下超聲乳化180 s，得到O1′/O2/W預復乳;攪拌下，加入水75 mL進行稀釋，室溫下于通風櫥內避光攪拌過夜;最后將上述乳液于4 ℃下以10 000 r/min離心15 min，棄去上清液，收集沉淀以水5 mL進行分散，即得羥基喜樹堿納米粒。檢測該納米粒平均粒徑為（743.65±4.31）nm，平均Zeta電位為（16.24±0.45）mV;載藥量為31.8%（重復測定3次）。

2.2 羥基喜樹堿分析方法的建立

采用HPLC法進行檢測。

2.2.1 色譜條件 以Zorbax Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱;以0.1%三乙胺水溶液（用磷酸調pH至3.0）-乙腈（73 ∶ 27，V/V）為流動相;流速為0.6 mL/min;柱溫為30 ℃;檢測波長為384 nm;進樣量為10 μL。

2.2.2 系列標準溶液的配制 精密稱取羥基喜樹堿對照品適量，用甲醇溶解制成質量濃度為1 000 mg/L的貯備液，再用甲醇進一步稀釋制成質量濃度分別為36、24、18、12、6、3、1.5、0.3、0.15、0.075 mg/L的系列標準溶液，于4 ℃下密封保存，備用。

2.2.3 內標溶液的配制 精密稱取喜樹堿對照品1.0 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成質量濃度為100 mg/L的內標溶液，于4 ℃下密封保存，備用。

2.2.4 血漿和組織勻漿的制備 于大鼠眼眶取血，采集的血樣置于含有肝素鈉的離心管中，以6 000 r/min離心10 min，分離血漿，于-20 ℃下保存，備用。摘取大鼠心、肝、脾、肺、腎、腦，用生理鹽水洗凈，濾紙吸干水分，稱定質量后加生理鹽水研磨，制成組織勻漿，于4 ℃下保存，備用。

2.2.5 樣品預處理 精密吸取大鼠血漿或組織勻漿樣品200 μL，置于2 mL離心管中，加入內標溶液20 μL，渦旋混勻3 min，再加入乙腈1.2 mL，靜置5 min后，以6 000 r/min離心10 min，吸取上清液1.0 mL，以氮氣流吹干，殘渣用甲醇100 μL渦旋3 min復溶，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，待測。

2.2.6 專屬性考察 取大鼠空白血漿和空白心、肝、脾、肺、腎、腦組織勻漿樣品，空白血漿和各組織勻漿+羥基喜樹堿（6 mg/L）樣品，大鼠尾靜脈注射給藥30 min后的含藥血漿和含藥組織勻漿樣品，按“2.2.5”項下方法處理（各空白生物樣品不加內標）后，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，羥基喜樹堿與內標色譜峰的峰形對稱且分離度好，保留時間分別為12.6、31.4 min，且無內源性雜質干擾，表明方法專屬性好，詳見圖1。

2.2.7 線性關系考察 精密吸取大鼠空白血漿和空白心、肝、脾、肺、腎、腦組織勻漿各200 μL，加入“2.2.2”項下羥基喜樹堿系列標準溶液適量，分別制成質量濃度分別均為0.025、0.05、0.1、0.5、1、2、4、6、8、12、16 mg/L的系列血漿樣品和0.05、0.1、0.5、1、2、4、6、8、12 mg/L的系列組織樣品，按“2.2.5”項下方法處理后，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（x，mg/L）為橫坐標、待測成分與內標峰面積比值（y）為縱坐標進行線性回歸。結果，血漿樣品中羥基喜樹堿檢測質量濃度的線性范圍為0.025～16 mg/L（r>0.999），定量下限為0.025 mg/L;各組織樣品中該成分檢測質量濃度的線性范圍均為0.05～12 mg/L（r>0.99），定量下限均為0.5 mg/L，詳見表1。

2.2.8 精密度與準確度試驗 精密吸取空白血漿和空白心、肝、脾、肺、腎、腦組織勻漿各200 μL，按“2.2.7”項下方法制成定量下限（0.025 mg/L）以及低、中、高質量濃度（0.1、1、8 mg/L，濃度按預試驗結果設置，下同）的血漿樣品和定量下限（0.05 mg/L）以及低、中、高質量濃度（0.5、2、8 mg/L，濃度按預試驗結果設置，下同）的組織樣品，按“2.2.5”項下方法處理后，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。其中，同日內連續測定5次考察日內精密度;每日測定1次、連續測定5 d考察日間精密度;以實測質量濃度與理論質量濃度的百分比考察準確度，結果見表2。結果，血漿樣品和各組織樣品中羥基喜樹堿的日內、日間RSD均小于10%，準確度均大于75%，符合方法學要求[7]。

2.2.9 提取回收率 精密吸取空白血漿和空白心、肝、脾、肺、腎、腦組織勻漿各200 μL，按“2.2.8”項下方法制成低、中、高質量濃度的血漿樣品和組織樣品各5份，按“2.2.5”項下方法處理后，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄羥基喜樹堿與內標的峰面積之比（A1）;另取空白血漿和空白心、肝、脾、肺、腎、腦組織勻漿各200 μL，按“2.2.5”項下方法處理后，加入羥基喜樹堿標準溶液使其質量濃度與上述相同，進樣測定，記錄峰面積之比（A2），以A1/A2×100%計算提取回收率，結果見表3。結果，血漿樣品和各組織樣品的提取回收率均大于80%（RSD<10%，n=5）。

2.2.10 穩定性試驗 按“2.2.8”項下方法制備低、中、高質量濃度的血漿樣品和組織樣品，分別于室溫放置24 h、-20 ℃放置24 h、反復凍融（-20℃～室溫）3次后，按“2.2.5”項下方法處理，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。每樣品重復測定5次，結果見表4。結果，血漿樣品和各組織樣品在上述條件下放置，穩定性良好（RSD<10%，n=5），符合方法學要求[7]。

2.3 藥動學實驗

取大鼠12只，適應性飼養1周后，禁食不禁水12 h，隨機分為受試組（給予自制羥基喜樹堿納米粒）和參照組（給予市售羥喜樹堿注射液），每組6只。各組大鼠均單次尾靜脈注射相應藥物4 mg/kg（以羥基喜樹堿計，劑量設置參考文獻[8]），分別在給藥后5、30、60、120、240、360、480、600、720 min時于眼底靜脈叢取血500 μL，分離血漿，按“2.2.5”項下方法處理后，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并代入回歸方程計算各個時間點大鼠體內羥基喜樹堿的血藥濃度。使用DAS 3.0軟件和Graphpad Prism 7軟件計算羥基喜樹堿的藥動學參數并作圖，采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。數據以x±s表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。結果，自制羥基喜樹堿納米粒和市售羥喜樹堿注射液在大鼠體內均符合二室模型，其藥-時曲線及藥動學參數見圖2、表5。與羥喜樹堿注射液比較，羥基喜樹堿納米粒的AUC0-720 min、AUC0-∞均顯著升高，MRT0-720 min、MRT0-∞、t1/2β均顯著延長（P<0.05），其中納米粒AUC0-720 min和AUC0-∞分別為注射液的1.89和1.87倍，MRT0-720 min和MRT0-∞分別為注射液的2.74和3.00倍，t1/2β為注射液的2.75倍;同時，給藥360 min后，羥喜樹堿注射液在血漿中難以被檢出，而羥基喜樹堿納米粒在給藥720 min后仍能被檢出，表明納米粒可延長羥基喜樹堿的半衰期并延長其在體內的作用時間。

2.4 組織分布實驗與靶向性評價

2.4.1 組織分布實驗 另取大鼠48只，適應性飼養1周后，禁食不禁水12 h，隨機分為受試組（給予自制羥基喜樹堿納米粒）和參照組（給予市售羥喜樹堿注射液），每組24只。各組大鼠均單次尾靜脈注射相應藥物0.6 mg/kg（以羥基喜樹堿計，劑量設置參照文獻[9]和前期預實驗結果），分別在給藥后30、60、120、240 min時于腹主動脈取血0.5 mL，分離血漿;然后迅速摘取其心、肝、脾、肺、腎、腦組織制成組織勻漿;按“2.2.5”項下方法進行處理后，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并代入回歸方程計算各個時間點羥基喜樹堿的質量濃度，結果見表6。結果，給藥后30 min時，羥基喜樹堿納米粒及其注射液在肺中濃度最高;隨著時間的推移，藥物逐漸向肝部位積累，在60 min時肝藥濃度達到最高，此時羥基喜樹堿納米粒的肝藥濃度是其注射液的6.02倍。此外，羥基喜樹堿納米粒肝藥濃度的下降速率低于羥喜樹堿注射液，提示羥基喜樹堿納米粒在肝臟中有一定的蓄積。

2.4.2 靶向性評價 納米給藥系統屬于靶向給藥系統，主要評價指標有相對攝取率（Re）、靶向效率（Te）、選擇性指數（Si），其中Re和Te反映整個代謝過程的靶向性，Si反映各時間點的靶向性，其數值越大即靶向性越強[10-12]。Re=AUCt/AUCc（AUC為AUC0-720 min，t為靶向制劑，c為非靶向制劑），Te=AUCT/AUCNT（T為靶器官，NT為非靶器官，下同），Si=cT/cNT。結果，羥基喜樹堿納米粒在肝的Re值最大，為6.28（>1），表明羥基喜樹堿納米粒對肝具有較強的靶向性，因此推測肝為靶器官。此外，羥基喜樹堿納米粒在血漿中的Re值為1.40（>1），進一步反映自制納米粒具有一定的長循環作用[13]。后續以肝作為靶器官計算Te值和Si值，結果見表7、表8。對比各組織的Te值發現，羥基喜樹堿納米粒均高于羥喜樹堿注射液，尤其在心、腎、腦和血漿中Te值均大于6，表明相比于羥喜樹堿注射液，納米粒能提高藥物在各組織內的蓄積量[12]。對比兩藥在各時間點的Si值發現，除在肺組織（30 min）外，羥基喜樹堿納米粒的Si值均大于1，表明各時間點藥物在肝中的濃度普遍高于其他組織，肝靶向性顯著;且隨著時間的延長，肝靶向性明顯強于羥喜樹堿注射液。經配對t檢驗分析發現，在給藥后30～240 min時間段內，羥基喜樹堿納米粒在心、肺（除給藥后30 min外）、腎、腦、血漿中的Si值均顯著高于羥喜樹堿注射液（P<0.05或P<0.01）。

3 討論

PLGA-PEG類嵌段共聚物具有良好的生物相容性和機械性能[14]，其作為納米粒外殼，能明顯提高難溶性藥物羥基喜樹堿親水性，發揮緩釋作用并提高藥物生物利用度，因此其相應制劑具有長循環及被動靶向能力[15]。雖然PLGA-PEG外殼能依靠高滲透長滯留（EPR）效應將藥物被動靶向到腫瘤部位，但無法進一步提高腫瘤部位的藥物累積量[16]。為了進一步提高對腫瘤組織的靶向效率，本研究在PLGA-PEG表面連接了小分子靶向基團葉酸，借助后者能與腫瘤組織或細胞表面的葉酸受體特異性結合的性質，實現腫瘤組織靶向性。

藥動學實驗表明，羥基喜樹堿納米粒通過尾靜脈注射進入大鼠體內后，其AUC、MRT、t1/2β均顯著高于或長于羥喜樹堿注射液，說明納米粒在血漿中作用時間更長、消除更慢、體內長循環效果更好。組織分布實驗結果表明，無論羥基喜樹堿納米粒還是羥喜樹堿注射液，藥物在肝和肺中的濃度均普遍高于其他組織，表現出羥基喜樹堿趨向肝、肺蓄積的特性，這可能與羥基喜樹堿主要經過肝代謝且肺部巨噬細胞較多，容易攝取藥物等有關，與文獻報道基本一致[17-18]。由于納米載藥系統改變了藥物在體內的分布特征，導致納米粒在體內的分布與羥基喜樹堿注射液相比有較大的差異。且隨著時間延長，羥基喜樹堿納米粒的肝藥濃度高于注射液，但羥基喜樹堿納米粒是否會產生潛在的毒性，還需進一步實驗的證實。此外，通過Te、Re、Si等3個靶向指標可以看出羥基喜樹堿納米粒的肝靶向性顯著，且優于羥喜樹堿注射液。

綜上所述，羥基喜樹堿納米粒延長了藥物的半衰期、提高了其血藥濃度、延長了其體內作用時間，且肝靶向性顯著。

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（收稿日期：2020-09-27 修回日期：2020-12-11）

（編輯：鄒麗娟）