濱蒿內(nèi)酯對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護作用研究

彭靜 陳曦

摘 要 目的：研究濱蒿內(nèi)酯對四氯化碳（CCl4）致小鼠急性肝損傷的保護作用及潛在分子機制。方法：將50只雄性昆明種小鼠隨機分為正常對照組、模型組、水飛薊素組（陽性對照，120 mg/kg）和濱蒿內(nèi)酯高、低劑量組（60、30 mg/kg），每組10只。各給藥組小鼠均灌胃相應(yīng)藥物，正常對照組和模型組小鼠灌胃等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，每日1次，連續(xù)給藥7 d。末次給藥結(jié)束2 h后，除正常對照組小鼠腹腔注射等體積橄欖油外，其余組小鼠均一次性腹腔注射0.1%CCl4橄欖油溶液（1 mL/100 g）以建立急性肝損傷模型。采用蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察小鼠肝組織病理性改變;采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測小鼠血清中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）的活性和白細胞介素1β（IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、丙二醛（MDA）的含量;采用蛋白免疫印跡法檢測小鼠肝組織中核因子κB（NF-κB）通路相關(guān)蛋白[NF-κB p65、核因子κBα激酶抑制蛋白（IκBα）]的磷酸化水平。結(jié)果：與正常對照組比較，模型組小鼠血清中AST、ALT活性和MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α含量均顯著升高，SOD、CAT活性均顯著降低（P<0.05）;肝組織出現(xiàn)明顯的病理性改變，且肝組織中NF-κB p65和IκBα蛋白的磷酸化水平均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，水飛薊素組和濱蒿內(nèi)酯高、低劑量組小鼠血清中相關(guān)因子活性或含量水平均顯著逆轉(zhuǎn)（P<0.05）;肝組織病理性改變程度明顯減輕，且肝組織中NF-κB p65和IκBα蛋白的磷酸化水平均顯著降低（P<0.05）。結(jié)論：濱蒿內(nèi)酯對CCl4所致小鼠急性肝損傷具有保護作用，該作用與降低氧化應(yīng)激水平以及阻斷NF-κB通路的活化、進而抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 濱蒿內(nèi)酯;急性肝損傷;NF-κB通路;氧化應(yīng)激;炎癥;小鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the protective effects of scoparone on acute liver injury induced by CCl4 in mice and its potential molecular mechanism. METHODS： Fifty male Kunming mice were randomly divided into normal control group， model group， silymarin group （positive control， 120 mg/kg）， scoparone high-dose and low-dose groups （60， 30 mg/kg）， with 10 mice in each group. Administration groups were given relevant medicine intragastrically. Normal control group and model group were given constant volume of 0.5% sodium carboxymethyl cellulose solution， once a day， for 7 days. Two hours after last medication， except normal control group was intraperitoneally injected constant volume of olive oil， other groups were intraperitoneally injected 0.1% CCl4 olive oil solution （10 mL/kg） at one time to establish the acute liver injury model. The pathological changes of liver tissues in mice were observed by HE staining; the activity of AST， ALT， SOD and CAT and the contents of IL-1β， IL-6， TNF-α and MDA in serum were measured by ELISA; the phosphorylation of nuclear factor κB （NF-κB） pathway related proteins （NF-κB p65， IκBα） in liver tissue were detected by Western blotting assay. RESULTS： Compared with normal control group， serum activities of AST and ALT， the contents of MDA， IL-1β， IL-6 and TNF-α were significantly increased in model group， the activities of SOD and CAT were decreased significantly（P<0.05）;obvious pathological changes were observed in liver tissues; phosphorylation levels of NF-κB p65 and IκBα protein in liver tissues were significantly increased （P<0.05）. Compared with model group， the activities or contens of related factors in serum of mice were significantly reversed in silymarin group and scoparone high-dose and low-dose groups （P<0.05）; the pathological changes of liver tissues were significantly reduced; the phosphorylation levels of NF-κB p65 and IκBα protein in liver tissues were significantly reduced （P<0.05）. CONCLUSIONS： Scoparone has a protective effect on CCl4-induced acute liver injury in mice， which is related to reducing oxidative stress levels and blocking the activation of NF-κB pathway， thereby inhibiting inflammatory response.

KEYWORDS? ?Scoparone; Acute liver injury; NF-κB pathway; Oxidative stress; Inflammation; Mice

中圖分類號 R965 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）02-0231-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.02.18

濱蒿內(nèi)酯為傳統(tǒng)中藥濱蒿Artemisia scoparia Waldst. et Kit.、茵陳蒿Artemisia capillaries Thunb.和石斛Dendrobium Sw.中的有效成分，又名七葉內(nèi)酯二甲醚、6，7-二甲氧基香豆素、東喘寧、蒿屬香豆精等，具有平喘止咳、抗輻射、抑制免疫、舒張血管、調(diào)血脂、消炎鎮(zhèn)痛和降血壓等功效，臨床上主要用于支氣管哮喘、心絞痛及冠心病等癥的治療[1]。近年來，濱蒿內(nèi)酯在非酒精性脂肪性肝病的治療中表現(xiàn)出較好的效果，具有減輕肝組織脂肪性改變等作用，逐漸得到人們的重視[2]。體外研究證實，濱蒿內(nèi)酯能通過使轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）/Smad信號通路失活，進而抑制肝星狀細胞的增殖，表明其具有潛在的治療肝纖維化的作用[3]。D-半乳糖胺（D-GalN）/脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的肝損傷模型的病理改變與人類病毒性肝炎的病理改變較為接近，研究人員也發(fā)現(xiàn)，濱蒿內(nèi)酯可以通過抑制Toll樣受體4（TLR-4）介導(dǎo)的炎癥通路來減輕D-GalN/LPS誘導(dǎo)的小鼠肝損傷[4]。四氯化碳（CCl4）可破壞肝組織，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化及炎癥反應(yīng)，是肝損傷研究中廣泛使用的經(jīng)典造模化合物;同時，核因子κB（NF-κB）信號通路在CCl4致小鼠急性肝損傷引起的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用[5-6]。因此，本研究以CCl4致急性肝損傷模型小鼠為研究對象，在進一步證實濱蒿內(nèi)酯對模型小鼠肝損傷具有保護作用的基礎(chǔ)上，著重探討該作用與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及NF-κB通路的相關(guān)性，初步闡明濱蒿內(nèi)酯的肝保護作用機制，為將其開發(fā)成為肝損傷防治藥物奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

實驗使用的儀器有：ESJ200-4A型電子天平（沈陽龍騰電子有限公司）、HC-2518RHC型高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）、CX31型生物顯微鏡（日本Olympus公司）、L5型紫外-可見分光光度計（上海儀分科學(xué)儀器有限公司）、HBS-1096A型酶標分析儀（南京德鐵實驗設(shè)備有限公司）、LF-Mini4型垂直電泳槽、LF-ZY02型轉(zhuǎn)印槽（北京龍方科技有限公司）、ChemiDoc XRS+型全自動凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）等。

1.2 藥品與試劑

濱蒿內(nèi)酯對照品（批號20180215，純度>95.0%）購自成都普利斯生物科技有限公司;水飛薊素對照品（陽性對照，批號0171204，純度>98.0%）購自盤錦格林恩生物資源開發(fā)有限公司;羧甲基纖維素鈉（批號s14016）購自上海源葉生物科技有限公司;CCl4（分析純）購自上海阿拉丁生化科技股份公司;丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、白細胞介素1β（IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒（批號分別為180325、180124、180613、180417、180903、180419、180525、180716）均購自南京建成生物工程研究所;蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（批號PC0020）、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量檢測試劑盒（批號G1120）、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗（批號PC8020）均購自北京索萊寶科技有限公司;小鼠NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）、核因子κBα激酶抑制蛋白（IκBα）、磷酸化IκBα（p-IκBα）單克隆抗體（批號分別為sc-8008、sc-166748、sc-1643、sc-8404）均購自美國Santa Cruz公司;底物化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑購自環(huán)亞生物科技有限公司;氯化鈉注射液（國藥準字H20033128，規(guī)格200 mL ∶ 1.8 g;作生理鹽水用）購自山東華魯制藥有限公司;其余試劑均為市售分析純，水為蒸餾水。

1.3 動物

實驗所用動物為清潔級昆明種小鼠，雄性，體質(zhì)量20～22 g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2014-0004。

2 方法

2.1 分組與給藥

將50只小鼠隨機分為正常對照組、模型組、水飛薊素組（120 mg/kg）和濱蒿內(nèi)酯高、低劑量組（60、30 mg/kg），每組10只。其中，水飛薊素給藥劑量參考文獻[7]設(shè)置，濱蒿內(nèi)酯給藥劑量參考文獻[4]并結(jié)合本課題組前期預(yù)實驗結(jié)果設(shè)置;藥物均以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液為溶劑配制成適宜濃度給藥。各給藥組小鼠均灌胃給藥，灌胃體積為2 mL/100 g，每日1次，連續(xù)給藥7 d;正常對照組和模型組小鼠同法灌胃等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。末次給藥結(jié)束2 h后，模型組和各藥物組小鼠均一次性腹腔注射0.1%CCl4溶液（以市售橄欖油為溶劑稀釋），注射體積為1 mL/100 g;正常對照組小鼠腹腔注射等體積橄欖油。

2.2 血清中AST、ALT活性檢測

小鼠腹腔注射CCl4溶液或等體積橄欖油18 h后，摘眼球取血，血樣以3 000 r/min離心5 min，分離上層血清。將血清分裝于EP管中，于-20 ℃保存。檢測前，取部分凍存血清，室溫解凍后，采用ELISA法以酶標分析儀檢測AST、ALT活性，操作步驟嚴格按照相應(yīng)試劑盒說明書進行。

2.3 肝組織病理學(xué)檢測

摘眼球取血結(jié)束后，頸椎脫臼處死小鼠并于無菌條件下分離其肝組織。取部分肝組織（其余部分凍存，備測），置于4%福爾馬林溶液固定24 h，石蠟包埋，切片（8 μm），再經(jīng)HE法染色后，置于生物顯微鏡下觀察小鼠肝組織病理性改變情況。

2.4 血清中SOD、CAT活性及MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α含量檢測

取“2.2”項下凍存血清，室溫解凍后，采用ELISA法以酶標分析儀檢測小鼠血清中SOD、CAT活性以及MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α含量，操作步驟嚴格按照相應(yīng)試劑盒說明書進行。

2.5 肝組織中NF-κB通路相關(guān)蛋白表達的檢測

采用蛋白免疫印跡法進行檢測。取“2.3”項下凍存的剩余肝臟組織，室溫解凍后，加入生理鹽水制備10%肝組織勻漿液，以3 000 r/min離心5 min，取組織勻漿上清液。采用BCA蛋白定量檢測試劑盒進行蛋白定量后，進行加熱變性處理。取變性蛋白適量，進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜，于4 ℃下用5%脫脂奶粉封閉2 h;加入NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα一抗（稀釋度1 ∶ 1 000），于4 ℃下孵育過夜;用TBST緩沖液洗膜，加入二抗（稀釋度1 ∶ 2 000），室溫孵育2 h;用TBST緩沖液洗膜，采用ECL法曝光，在凝膠成像分析系統(tǒng)中進行成像、拍照。用Quantity One 4.6.6軟件分析各目標蛋白條帶的灰度值，分別計算p-NF-κB p65/NF-κB p65和p-IκBα/IκBα條帶灰度值的比值，用以表示相應(yīng)蛋白的磷酸化水平。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均用x±s表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 濱蒿內(nèi)酯對急性肝損傷模型小鼠血清中AST、ALT活性的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠血清中AST、ALT活性均顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，水飛薊素組和濱蒿內(nèi)酯高、低劑量組小鼠血清中AST、ALT活性均顯著降低（P<0.05），詳見表1。

3.2 濱蒿內(nèi)酯對急性肝損傷模型小鼠肝組織病理性改變的影響

鏡下可見，正常對照組小鼠肝細胞形態(tài)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞索規(guī)則排列，肝組織結(jié)構(gòu)未見病理性改變;模型組小鼠肝組織中炎性細胞浸潤明顯，肝細胞索排列紊亂，肝小葉界限模糊，肝組織結(jié)構(gòu)可見明顯病理性改變;與模型組比較，水飛薊素組和濱蒿內(nèi)酯高、低劑量組小鼠肝組織病理性改變程度明顯減輕，炎性細胞浸潤減少，肝細胞形態(tài)及肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，結(jié)果詳見圖1（圖中箭頭所指為炎性反應(yīng)點）。

3.3 濱蒿內(nèi)酯對急性肝損傷模型小鼠血清中SOD、CAT活性及MDA含量的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠血清中SOD、CAT活性均顯著降低，MDA含量顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，水飛薊素組和濱蒿內(nèi)酯高、低劑量組小鼠血清中SOD、CAT活性均顯著升高，MDA含量均顯著降低（P<0.05），詳見表2。

3.4 濱蒿內(nèi)酯對急性肝損傷模型小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量均顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，水飛薊素組和濱蒿內(nèi)酯高、低劑量組小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量均顯著降低（P<0.05），詳見表3。

3.5 濱蒿內(nèi)酯對急性肝損傷模型小鼠肝組織中NF-κB通路相關(guān)蛋白表達的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠肝組織中NF-κB p65和IκBα蛋白的磷酸化水平均顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，水飛薊素組及濱蒿內(nèi)酯高、低劑量組小鼠肝組織中NF-κB p65和IκBα蛋白的磷酸化水平均顯著降低（P<0.05），詳見表4、圖2。

4 討論

肝臟是人體能量供應(yīng)與轉(zhuǎn)換、物質(zhì)代謝的樞紐器官，肝損傷疾病嚴重影響著人們的身體健康和生活質(zhì)量。研究指出，引起肝損傷的原因有多種，如病毒性肝損傷、酒精性肝損傷、免疫性肝損傷和化學(xué)性肝損傷等，其中化學(xué)性肝損傷的主要病理改變包括肝纖維化、脂肪變性及肝硬化等[8]。中藥具有歷史悠久、資源豐富、療效確切的優(yōu)點，近年來采用中藥治療肝損傷逐漸成為相關(guān)治療領(lǐng)域的研究熱點[9]。CCl4致小鼠急性肝損傷是一種經(jīng)典的肝損傷模型，其操作簡單、重現(xiàn)性好、應(yīng)用廣泛[10]。血清AST和ALT是反映肝功能的重要指標，當肝功能發(fā)生異常時，二者水平急劇升高[11]。本研究通過給予不同劑量的濱蒿內(nèi)酯預(yù)處理小鼠后，再采用腹腔注射CCl4溶液的方式建立小鼠急性肝損傷模型，結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組小鼠血清中AST、ALT活性均顯著升高，肝組織出現(xiàn)了明顯的病理性改變，表明模型建立成功;與模型組比較，水飛薊素組和濱蒿內(nèi)酯高、低劑量組小鼠血清中AST、ALT活性均顯著降低，肝組織病理性改變程度明顯減輕，表明濱蒿內(nèi)酯對CCl4所致小鼠急性肝損傷具有一定的保護作用。

氧化應(yīng)激以機體內(nèi)抗氧化和氧化作用失去平衡為主要特征，會生成大量的氧化中間產(chǎn)物，引起蛋白酶分泌增加、中性粒細胞浸潤等，是導(dǎo)致衰老和疾病的重要因素[12]。在CCl4致急性肝損傷模型小鼠體內(nèi)，其血清中抗氧化酶SOD、CAT活性均顯著降低，而氧化應(yīng)激終產(chǎn)物MDA含量顯著升高，表明CCl4可以引起肝組織脂質(zhì)過氧化的發(fā)生[13]。研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿可以通過緩解氧化應(yīng)激水平來發(fā)揮對CCl4致急性肝損傷模型小鼠的保護作用[14];草蓯蓉水萃取物也可以通過升高SOD、CAT、谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽的活性，降低肝勻漿MDA含量，從而緩解CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷[15]。本研究也同樣發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，模型組小鼠血清中SOD、CAT活性均顯著降低，MDA含量顯著升高;與模型組比較，水飛薊素組和濱蒿內(nèi)酯高、低劑量組小鼠血清中SOD、CAT活性均顯著升高，MDA含量均顯著降低，提示濱蒿內(nèi)酯對CCl4所致小鼠急性肝損傷的保護作用可能與降低氧化應(yīng)激水平有關(guān)。

炎癥反應(yīng)在CCl4致小鼠急性肝損傷中發(fā)揮著重要作用，其中IL-1β、IL-6和TNF-α是主要的促炎因子[16]。IL-1β的生物學(xué)作用廣泛，可激活補體并介導(dǎo)Ig的分泌，也可以吞噬和殺傷細胞，加重由體液免疫和細胞免疫所導(dǎo)致的組織損傷[17]。IL-6一方面可以通過旁路或經(jīng)典途徑使補體激活，引發(fā)炎癥和肝細胞的損傷;另一方面，也可以通過增強細胞毒性 T 細胞殺傷肝細胞的能力，加重肝臟的病理性損傷和炎癥[18]。TNF-α可以由肝枯否細胞表達和分泌，可以直接殺傷肝細胞[19]。姚紅月等[20]研究發(fā)現(xiàn)，CCl4致急性肝損傷大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量均顯著升高，而人參二醇組皂苷可以通過降低上述指標水平從而發(fā)揮肝保護作用。本研究也同樣發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，模型組小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量均顯著升高;與模型組比較，水飛薊素組和濱蒿內(nèi)酯高、低劑量組小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量均顯著降低，表明濱蒿內(nèi)酯對CCl4所致小鼠急性肝損傷的保護作用可能與抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

研究表明，NF-κB通路參與了炎癥反應(yīng)的發(fā)生與進展[21]。在正常生理條件下，NF-κB蛋白與IκB蛋白以無活性復(fù)合物的形式存在于細胞質(zhì)中;而當機體受到刺激時，NF-κB蛋白被磷酸化后轉(zhuǎn)入細胞核，進而促進IκB蛋白的磷酸化，啟動多種靶基因轉(zhuǎn)錄，分泌并釋放IL-1β、IL-6、TNF-α等多種促炎因子，使炎癥過程持續(xù)和放大[22]。研究證實，抑制NF-κB p65和IκBα蛋白磷酸化水平的增加，進而阻斷NF-κB通路的活化，對預(yù)防和治療CCl4致小鼠急性肝損傷具有重要意義[23-25]。為了探索濱蒿內(nèi)酯抑制CCl4致小鼠急性肝損傷的炎癥相關(guān)機制，本研究采用蛋白免疫印跡法檢測了小鼠肝組織中NF-κB p65和IκBα蛋白的磷酸化水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，模型組小鼠肝組織中NF-κB p65和IκBα蛋白的磷酸化水平均顯著升高;與模型組比較，水飛薊素組和濱蒿內(nèi)酯高、低劑量組小鼠肝組織中NF-κB p65和IκBα蛋白的磷酸化水平均顯著降低。以上結(jié)果進一步證實，濱蒿內(nèi)酯可阻斷NF-κB通路的活化、進而抑制炎癥反應(yīng)，是其發(fā)揮肝損傷保護作用的潛在機制之一。

綜上所述，濱蒿內(nèi)酯對CCl4致小鼠急性肝損傷具有明顯的保護作用，該作用與降低氧化應(yīng)激水平以及阻斷NF-κB通路的活化、進而抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

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（收稿日期：2020-07-02 修回日期：2020-12-19）

（編輯：段思怡）