滇黃芩莖葉乙醇提取物及其不同溶劑萃取部位的抗氧化和降脂活性研究

李欣坪 王蒙蒙 王子晨 方瓊蓮 林玉萍

摘 要 目的：研究滇黃芩莖葉乙醇提取物及其不同溶劑萃取部位的抗氧化活性和降脂活性。方法：取滇黃芩莖葉用95%乙醇回流提取，得乙醇提取物;取上述提取物，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑得到不同溶劑萃取部位。以維生素C（Vc）為陽性對照，采用羥基自由基、超氧陰離子自由基、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除法檢測滇黃芩莖葉乙醇提取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物的體外抗氧化活性并計算半數抑制濃度（IC50）。以脂肪乳建立脂肪變性L02肝細胞模型，以非諾貝特（20 μg/mL）為陽性對照，考察高、低質量濃度（100、50 μg/mL）滇黃芩莖葉乙醇提取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物對細胞中TC、TG含量的影響。結果：對羥基自由基的清除能力強弱排序為滇黃芩莖葉正丁醇萃取物>乙酸乙酯萃取物>Vc>乙醇提取物>石油醚萃取物，IC50分別為0.15、0.17、0.35、0.75、1.17 mg/mL;對超氧陰離子自由基的清除能力強弱排序為Vc>正丁醇萃取物>乙酸乙酯萃取物>乙醇提取物>石油醚萃取物，IC50分別為0.034、0.55、0.75、3.32、3.73 mg/mL;對DPPH自由基的清除能力強弱排序為Vc>正丁醇萃取物>乙酸乙酯萃取物>乙醇提取物>石油醚萃取物，IC50分別為0.003 2、0.028、0.033、0.048、0.057 mg/mL。滇黃芩莖葉乙醇提取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物對脂肪變性L02肝細胞中TC、TG含量均有顯著的降低作用（P<0.01），其降脂能力強弱排序為正丁醇萃取物（低濃度）≈非諾貝特>乙酸乙酯萃取物（高濃度）>乙醇提取物（高濃度）>正丁醇萃取物（高濃度）>乙酸乙酯萃取物（低濃度）>乙醇提取物（低濃度）。結論：滇黃芩莖葉乙醇提取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物均有一定的抗氧化活性和降脂活性（除石油醚萃取物外），其中正丁醇和乙酸乙酯萃取物的抗氧化活性和降脂活性較高。

關鍵詞 滇黃芩莖葉;乙醇提取物;抗氧化活性;降脂活性

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the antioxidant activity and lipid-lowering effect of ethanol extract and its different solvent extracts from the stems and leaves of Scutellaria amoena. METHODS： The stem and leaves of S. amoena was extracted with 95% ethanol to obtain ethanol extract， and then extracted with petroleum，ethyl acetate and n-butanol to obtain corresponding different solvent extracts. Using vitamin C （Vc） as positive control， the antioxidant activities of ethanol extract， petroleum ether extract， ethyl acetate extract and n-butanol extract from the stems and leaves of S. amoena were determined by hydroxyl radical， superoxide anion radical and DPPH radical scavenging method， and the IC50 was calculated. Steatosis L02 hepatocyte model was established with fat emulsion. Using fenofibrate （20 μg/mL） as positive control， the effects of high and low concentration （100 and 50 μg/mL） ethanol extract， ethyl acetate extract and n-butanol extract from the stems and leaves of S. amoena on the contents of TC and TG in cells were investigated. RESULTS： The order of scavenging ability to hydroxyl radicals was n-butanol extract>ethyl acetate extract>Vc>ethanol extract>petroleum ether extract; IC50 of them were 0.15， 0.17， 0.35， 0.75， 1.17 mg/mL， respectively. The order of scavenging ability to superoxide anion radical was Vc>n-butanol extract>ethyl acetate extract>ethanol extract>petroleum ether extract; IC50 of them were 0.034， 0.55， 0.75， 3.32， 3.73 mg/mL， respectively. The order of DPPH scavenging ability to DPPH radical was Vc>n-butanol extract>ethyl acetate extract>ethanol extract>petroleum ether extract; IC50 of them were 0.003 2， 0.028， 0.033， 0.048， 0.057 mg/mL， respectively. The ethanol extract， ethyl acetate extract and n-butanol extract from the stems and leaves of S. amoena could significantly decrease the contents of TC and TG in steatosis L02 hepatocytes （P<0.01）. The order of lipid-lowering ability was n-butanol extract（low dose）≈fenofibrate>ethyl acetate extract（high dose）>ethanol extract（high dose）>n-butanol extract（high dose）>ethyl acetate extract（low dose）>ethanol extract（low dose）. CONCLUSIONS： The ethanol extract， petroleum ether extract， ethyl acetate extract and n-butanol extract from the stems and leaves of S. amoena show good antioxidant activity and lipid-lowering effect （except for petroleum ether extract）. Ethyl acetate extract and n-butanol extract possess the strongest antioxidant activity and lipid-lowering effect.

KEYWORDS? ?Stem and leaves of Scutellaria amoena; Ethanol extract; Antioxidant activity; Lipid-lowering activity

中圖分類號 R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）02-0220-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.02.16

滇黃芩Scutellaria amoena C. H. Wright是云南地區多種民族藥的藥用資源，又名小黃芩、西南黃芩、土黃芩等，為唇形科黃芩屬植物，主要分布在我國云南、四川、貴州等地[1-2]。《滇南本草》《中國彝藥學》《云南民族藥大辭典》等書記載，滇黃芩性寒、味苦，歸肝、膽、胃、肺、大腸經，具有清肺胃熱、燥濕氣、消炎、解毒、安胎、止血等功效[3-4]。滇黃芩莖葉作為具有降脂作用的黃芩茶使用歷史悠久，其主要含有黃酮類化合物[5]。近年來，隨著對中藥黃芩研究的不斷深入，黃芩同屬植物的藥用價值日益受到國內外學者的關注，有關滇黃芩莖葉的藥用價值已成為研究熱點之一[6-7]。

現代藥理研究報道顯示，滇黃芩根部總黃酮具有較強的抗氧化活性，可抗心律失常并可阻滯心肌細胞鈉通道[8-10];滇黃芩莖葉還具有降脂作用，可降低高脂血癥模型大鼠的血脂水平[11]。但其醇提物及不同溶劑萃取部位抗氧化活性和降脂活性的比較研究尚未見報道。為此，本研究通過檢測滇黃芩莖葉乙醇提取物及其不同溶劑萃取部位對羥基自由基、超氧陰離子自由基、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的清除能力來評價其體外抗氧化活性;采用脂肪變性人L02肝細胞模型，通過檢測細胞內總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）含量的變化來評價其降脂活性，篩選其抗氧化和降脂活性的有效部位，為滇黃芩莖葉的進一步研究與開發奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器

本文所用實驗儀器有：UV2450型紫外-可見分光光度計（日本Shimadzu公司）、SHZ-D型循環水真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）、RE-2000A型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）、DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋（上海醫療器械股份有限公司醫療器械五廠）、BT2202S型電子天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]、Infinite M200 Pro型酶標儀（瑞士Tecan公司）、MCO-20AIC型CO2培養箱（日本Sanyo公司）、SK3300LH型超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

滇黃芩全株采自云南省新平縣，經云南中醫藥大學普春霞副教授鑒定為唇形科植物滇黃芩S. amoena C. H. Wright，取其莖葉進行研究。

20%脂肪乳注射液[批號201807，規格250 mL ∶ 50 g（大豆油） ∶ 3 g（卵磷脂）]購自四川科倫藥業股份有限公司，青霉素-鏈霉素雙抗溶液、0.25%胰蛋白酶、RPMI- 1640培養液、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）、胎牛血清（批號0010419、0040819、0020319、2012004、1906287）均購自以色列BI公司，非諾貝特膠囊（批號28212，規格200 mg/粒）購自美國A bbott Laboratories Limited公司，TC、TG檢測試劑盒（批號20200618、20200615）均購自南京建成生物工程研究所，DPPH購自美國Sigma公司，維生素C（Vc，批號20140102，純度≥99.7%）和七水硫酸鐵（FeSO4·7H2O）均購自廣東光華科技股份有限公司，Trition X-100試劑（批號FZ6688A189）購自廣州賽國生物科技有限公司，三羥甲基氨基甲烷（Tris）、磷酸二氫鈉、30%H2O2溶液、鄰苯三酚、鄰二氮菲、磷酸氫二鈉（均為分析純）均購自天津市風船化學試劑科技有限公司，無水乙醇、鹽酸、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇（均為分析純）均購自云南楊林工業開發區汕滇藥業有限公司;其余試劑均為分析純或實驗室常用規格，水為超純水。

1.3 細胞

正常人L02肝細胞株由中國科學院昆明動物研究所提供。

2 方法

2.1 滇黃芩莖葉乙醇提取物和不同溶劑萃取部位萃取物的制備

稱取干燥的滇黃芩莖葉400 g，加入95%乙醇3 200 mL，加熱回流提取3次，提取時間分別為2、1、1 h，減壓過濾，合并提取液，減壓蒸餾回收乙醇，干燥，得到滇黃芩莖葉乙醇提取物30.72 g（得率7.68%）。取上述乙醇提取物25 g，用水重懸，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇進行萃取，分別得到石油醚萃取物4.03 g（得率16.12%）、乙酸乙酯萃取物9.16 g（得率36.64%）、正丁醇萃取物3.42 g（得率13.68%）。

2.2 抗氧化試驗

2.2.1 樣品溶液的配制 分別稱取滇黃芩莖葉乙醇提取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和Vc各0.05 g，加水20 mL，超聲（功率200 W，頻率53 kHz）處理5 min，濾過，濾液用水定容于50 mL量瓶中，配制成質量濃度均為1.0 g/mL（以提取物或Vc質量計，下同）的母液，備用。臨用時用水稀釋至所需濃度，濃度按預試驗結果設置。

2.2.2 對羥基自由基的清除能力的檢測 參考文獻[12]方法，在10 mL具塞試管中，分別加入質量濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL（乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和Vc）或0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL（乙醇提取物、石油醚萃取物）的樣品溶液和0.75 mmol/L FeSO4·7H2O溶液各1 mL，再加入0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液和0.01%H2O2溶液各1 mL，于37 ℃保溫1 h，取出，使用紫外-可見分光光度計在536 nm波長處檢測吸光度（An′）;另以水替代H2O2溶液同法檢測吸光度（An），以水替代樣品溶液同法檢測吸光度（A0′），以水替代樣品溶液和H2O2溶液同法檢測吸光度（A0）。以Vc作為陽性對照，每個樣品重復檢測3次，取平均值，計算羥基自由基清除率：羥基自由基清除率（%）=[1-（An-An′）/（A0-A0′）]×100%。以清除率（y，%）為縱坐標、質量濃度（x，mg/mL）為橫坐標進行回歸分析，計算半數抑制濃度（IC50）。

2.2.3 對超氧陰離子自由基的清除能力的檢測 參考文獻[13]方法，在10 mL具塞試管中，分別加入質量濃度分別為0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07 mg/mL（Vc）或0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL（乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物）或1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL（乙醇提取物、石油醚萃取物）的樣品溶液1 mL、0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.2）4.5 mL，在25 ℃下恒溫水浴20 min，再加入3 mol/L的鄰苯三酚溶液0.5 mL，迅速混勻后于37 ℃下保溫5 min，立即加入濃鹽酸（8 mol/L）2滴終止反應，使用紫外-可見光光度計在425 nm波長處檢測吸光度（A1）;另以水替代鄰苯三酚溶液同法檢測吸光度（A2），以水替代樣品溶液同法檢測吸光度（A0）。以Vc作為對照，每個樣品重復檢測3次，取平均值，計算超氧陰離子自由基清除率：超氧陰離子自由基清除率（%）=[1-（A1-A2）/A0]×100%。按“2.2.2”項下方法計算IC50。

2.2.4 對DPPH自由基的清除能力的檢測 參考文獻[14]方法，在10 mL具塞試管中，分別加入質量濃度分別為0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006 mg/mL（Vc）或0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07 mg/mL（乙醇提取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物）的樣品溶液和0.125 mmol/L DPPH溶液各2 mL，混勻，于37 ℃水浴中反應30 min，使用紫外-可見光光度計在517 nm波長處檢測吸光度（A1）;以無水乙醇替代DPPH溶液同法檢測吸光度（A2），以無水乙醇替代樣品溶液同法檢測吸光度（A0）。以Vc作為對照，每個樣品重復檢測3次，取平均值，計算DPPH自由基清除率：DPPH自由基清除率（%）=[1-（A1-A2）/A0]×100%。按“2.2.2”項下方法計算IC50。

2.3 降脂試驗

2.3.1 供試品藥液的配制 分別精密稱滇黃芩莖葉乙醇提取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物（根據抗氧化活性結果選擇樣品，其中石油醚萃取物抗氧化活性欠佳，故不進行降脂試驗）各2.0 g，用二甲基亞砜（DMSO）溶解配制成質量濃度均為1 mg/mL的母液，再用RPMI- 1640培養液將其稀釋成100、50 μg/mL的供試品藥液。同法將非諾貝特（陽性對照）配制成質量濃度為20 μg/mL的供試品藥液。濃度按預試驗結果設置。

2.3.2 培養液和造模液的配制 （1）含0.2%胎牛血清的RPMI-1640培養液：將胎牛血清1 mL和青霉素-鏈霉素雙抗溶液5.6 mL加入至RPMI-1640培養液500 mL中，即得含0.2%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養液。（2）含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液：將胎牛血清55 mL和青霉素-鏈霉素雙抗溶液5.6 mL加入至RPMI-1640培養液500 mL中，即得含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養液。（3）10%醫用脂肪乳造模液：將醫用脂肪乳10 mL加入至含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液90 mL中，即得。

2.3.3 脂肪變性L02肝細胞模型的建立 參考文獻方法[15]，取對數生長期的L02肝細胞用0.25%胰蛋白酶消化，按5×105個/孔接種于6孔板中，于37 ℃、5%CO2培養箱及飽和濕度條件（培養條件下同）下培養，當細胞長至80%融合時，用含0.2%胎牛血清的RPMI-1640培養液進行饑餓處理24 h，使細胞周期同步化，隨后每孔加入10%醫用脂肪乳造模液2 mL，繼續培養24 h，以建立脂肪變性L02肝細胞模型。

2.3.4 分組、給藥與處理 將細胞周期同步化后的細胞分為正常對照組、模型組、非諾貝特組和提取物/萃取物高、低濃度組，每組設3個復孔。除正常對照組細胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液中培養24 h外，其余各組細胞均按“2.3.3”項下方法建模。建模后，正常對照組和模型組細胞分別加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液2 mL，非諾貝特組和提取物/萃取物高、低濃度組細胞分別加入“2.3.1”項下供試品藥液2 mL。培養24 h后，用PBS清洗細胞2～3次，收集細胞并置于1.5 mL離心管中，以2 000 r/min離心3 min，棄上清液，沉淀加入2%Triton X-100試劑30 μL，反復凍融3次，待細胞充分裂解后，于4 ℃下以5 000 r/min離心10 min，取上清液，按生化法以酶標儀測定TC和TG的含量，具體操作按試劑盒說明書操作。

2.4 數據處理

統計圖和回歸分析采用GraphPad Prism 5.0軟件處理，統計學分析使用SPSS 18.0軟件完成。結果均以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 滇黃芩莖葉乙醇提取物及其不同溶劑萃取部位對羥基自由基清除能力的影響

滇黃芩莖葉乙醇提取物及其不同溶劑萃取部位對羥基自由基均有不同程度的清除能力，其清除率有隨質量濃度增加而升高的趨勢。其中，滇黃芩莖葉乙醇提取物和石油醚萃取物對羥基自由基的清除能力均弱于Vc，而其乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物對羥基自由基的清除能力均強于Vc。各提取物/萃取物清除能力強弱（即IC50由小到大）排序為：正丁醇萃取物>乙酸乙酯萃取物>Vc>乙醇提取物>石油醚萃取物。回歸分析結果顯示，滇黃芩莖葉乙醇提取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的質量濃度與清除率的相關系數（R 2）均大于0.9，表明其對羥基自由基的清除能力與質量濃度之間具有良好的線性關系。滇黃芩莖葉乙醇提取物及其不同溶劑萃取部位對羥基自由基清除能力的影響見圖1，回歸分析結果見表1。

3.2 滇黃芩莖葉乙醇提取物及其不同溶劑萃取部位對超氧陰離子自由基清除能力的影響

滇黃芩莖葉乙醇提取物及其不同溶劑萃取部位對超氧陰離子自由基均有不同程度的清除能力，其清除率有隨質量濃度增加而升高的趨勢，但當乙醇提取物和石油醚萃取物的質量濃度≥4 mg/mL時，其清除率上升減慢。滇黃芩莖葉乙醇提取物及其不同溶劑萃取部位對超氧陰離子自由基的清除能力強弱（即IC50由小到大）排序為：Vc>正丁醇萃取物>乙酸乙酯萃取物>乙醇提取物>石油醚萃取物。回歸分析結果顯示，滇黃芩莖葉乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的質量濃度與清除率的R 2均大于0.9，表明其對超氧陰離子自由基的清除能力與質量濃度之間具有良好的線性關系。滇黃芩莖葉乙醇提取物及其不同溶劑萃取部位對超氧陰離子自由基清除能力的影響見圖2，回歸分析結果見表2。

3.3 滇黃芩莖葉乙醇提取物及其不同溶劑萃取部位對DPPH自由基清除能力的影響

滇黃芩莖葉乙醇提取物及其不同溶劑萃取部位對DPPH自由基均有不同程度的清除能力，其清除率有隨質量濃度增加而升高的趨勢。滇黃芩莖葉乙醇提取物及其不同溶劑萃取部位對DPPH自由基的清除能力強弱（即IC50由小到大）排序為：Vc>正丁醇萃取物>乙酸乙酯萃取物>乙醇提取物>石油醚萃取物。回歸分析結果顯示，滇黃芩莖葉乙醇提取物及其不同溶劑萃取部位的質量濃度與清除率的R 2均大于0.9，表明其對DPPH自由基的清除能力與質量濃度之間具有良好的線性關系。滇黃芩莖葉乙醇提取物及其不同溶劑萃取部位對DPPH自由基清除能力的影響見圖3，回歸分析結果見表3。

3.4 滇黃芩莖葉乙醇提取物及其不同溶劑萃取部位對脂肪變性L02肝細胞中TC、TG水平的影響

與正常對照組比較，模型組細胞中TC、TG含量均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組細胞中TC、TG含量均顯著降低（P<0.01），說明滇黃芩莖葉乙醇提取物及其不同溶劑萃取部位均能顯著降低脂肪變性L02細胞中的TC、TG水平，降脂活性強弱（即TC、TG變化程度）排序為：正丁醇萃取物（低濃度）≈非諾貝特>乙酸乙酯萃取物（高濃度）>乙醇提取物（高濃度）>正丁醇萃取物（高濃度）>乙酸乙酯萃取物（低濃度）>乙醇提取物（低濃度）。滇黃芩莖葉乙醇提取物及其不同溶劑萃取部位對脂肪變性L02肝細胞中TG、TC含量的影響見表4。

4 討論

自由基是機體正常代謝的產物，其含量輕微增加可提升機體抗氧化的能力;但當自由基含量過高時，其會攻擊細胞膜造成機體的損傷[16]。近年來醫學研究證實，諸多疾病，例如惡性腫瘤、動脈粥樣硬化、糖尿病、脂代謝異常等都與人體內異常積聚的自由基有關[17-18]。中藥含有的黃酮類、酚類、皂苷、多糖等化學成分具有良好的抗氧化活性，尋找天然抗氧化劑來清除人體內的自由基從而預防相關疾病的發生已成為研究熱點之一[19-21]。

本研究采用羥基自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基清除法對滇黃芩莖葉乙醇提取物及其不同溶劑萃取部位的抗氧化能力進行了評價。結果表明，滇黃芩莖葉乙醇提取物及其不同溶劑萃取部位對羥基自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基均表現出不同程度的清除作用，并呈一定的量效關系趨勢。其中，正丁醇和乙酸乙酯萃取物的抗氧化作用較強（IC50均相對較小），提示滇黃芩莖葉抗氧化活性成分可能主要集中在正丁醇和乙酸乙酯部位。本文同時以脂肪變性L02細胞中TC、TG含量的變化來評價具有顯著抗氧化活性的乙醇提取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物的降脂活性，并選擇了常用于治療高TG血癥、血脂異常、糖尿病等代謝性疾病的非諾貝特為陽性藥物[22]。研究表明，滇黃芩莖葉乙醇提取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物均能顯著降低脂肪變性L02細胞中TC、TG含量，具有明顯的降脂活性。

綜上所述，滇黃芩莖葉乙酸乙酯和正丁醇部位的抗氧化和降脂活性較強，可作為探究滇黃芩莖葉抗氧化和降脂活性部位繼續研究。

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（收稿日期：2020-09-13 修回日期：2020-12-13）

（編輯：鄒麗娟）