山萸肉及其不同酒制品的UPLC特征圖譜建立及色度值的差異性研究

黃瑤 張雪蘭 羅宇琴 鄧李紅 方朝纘 魏梅

摘 要 目的：建立山萸肉及其不同酒制品的特征圖譜，探討其色度值的差異性，并進行化學模式識別分析。方法：采用超高效液相色譜法（UPLC）。以馬錢苷為參照，繪制10批山萸肉及其20批不同酒制品（酒燉、酒蒸）的UPLC特征圖譜;采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012A）》進行相似度評價，確定共有峰;采用分光測色儀測定其色度值[明暗度（L）、紅綠色調值（a）、黃藍色調值（b）、色差值（ΔE）];采用SPSS 20.0、SIMCA 14.0軟件進行聚類分析、主成分分析、偏最小二乘法-判別分析，并以特征峰峰面積、色度值為指標，以變量重要性投影值大于1為標準，篩選影響飲片質量的差異標志物。結果：山萸肉飲片有6個共有峰，酒萸肉（酒燉）飲片和酒萸肉（酒蒸）飲片有7個共有峰;指認了其中沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、馬錢苷等4個成分，其中5-羥甲基糠醛為炮制后的新增成分。山萸肉與不同酒制品（酒燉、酒蒸）的相似度較低（0.869～0.937、0.845～0.944），而不同酒制品的相似度均高于0.99。山萸肉飲片與酒萸肉（酒燉）飲片的ΔL為-9.42～-3.58、Δa為-24.92～-15.00、Δb為-11.33～-7.00、ΔE為17.01～28.12，山萸肉飲片與酒萸肉（酒蒸）飲片的ΔL為-8.58～-2.42、Δa為-25.08～-13.83、Δb為-10.92～-6.08、ΔE為15.58～28.67，酒萸肉（酒燉）飲片與酒萸肉（酒蒸）飲片的ΔL為-2.17～3.00、Δa為-0.75～2.50、Δb為0.25～1.42、ΔE為1.25～3.83。聚類分析結果顯示，30批樣品可聚為兩類，S1～S10聚為一類、S11～S30聚為一類。主成分分析結果顯示，前兩個主成分的累積方差貢獻率為83.147%。偏最小二乘法-判別分析結果顯示，莫諾苷、5號峰、色度值（L、a、b）為影響其質量的差異標志物。結論：所建UPLC特征圖譜穩定、可行，結合色度值差異可快速鑒別山萸肉及其不同酒制品;所建化學模式可用于區分不同酒制品。

關鍵詞 山萸肉飲片;酒制品;超高效液相色譜法;特征圖譜;色度值;聚類分析;主成分分析;偏最小二乘法-判別分析

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish characteristic chromatogram of Cornus officinalis and its different wine-processed products， investigate the differences of chromaticity values， and analyze them with chemical pattern recognition technology. METHODS： UPLC method was adopted. Using loganin as reference， UPLC characteristic chromatograms were drawn for 10 batches of C. officinalis and 20 batches of different wine-processed products （stewing with wine， steaming with wine）. TCM Fingerprint Similarity Evaluation System （2012A edition） was used for similarity evaluation， and common peaks were confirmed. The chromaticity values [lightness （L）， red and green tone value （a）， yellow and blue tone value （b）， color difference value （ΔE）] were determined by spectrophotometer. SPSS 20.0 and SIMCA 14.0 software were used for cluster analysis， principal component analysis and partial least squares-discriminant analysis; taking the area of characteristic peak and chromaticity value as indexes， and the variable importance projection greater than 1 as the standard， the difference markers affecting its quality were screened. RESULTS： There were 6 common peaks in the chromatograms for decoction piece of C. officinalis， 7 common peaks for wine-processed C. officinalis （stewing with wine） and wine-processed C. officinalis （steaming with wine）. Four components were identified as gallic acid， 5-hydroxymethylfurfural， morroniside， loganin. 5-hydroxymethylfurfural was produced after processing. The similarity between C. officinalis and different wine-processed products （stewing and steaming with wine） was low （0.869-0.937， 0.845-0.944）， but the similarity between different wine-processed products was higher than 0.99. ΔL， Δa， Δb and ΔE of C. officinalis decoction pieces and wine-processed C. officinalis decoction pieces （stewing in wine） were -9.42--3.58， -24.92- -15.00， -11.33- -7.00 and 17.01-28.12， respectively. ΔL， Δa， Δb and ΔE of C. officinalis decoction pieces and wine-processed C. officinalis （steaming in wine） decoction pieces were -8.58--2.42， -25.08--13.83， -10.92--6.08， 15.58-28.67. ΔL， Δa， Δb and ΔE of wine-processed C. officinalis decoction pieces （stewing and steaming with wine） were -2.17-3.00， -0.75-2.50， 0.25-1.42 and 1.25-3.83， respectively. Results of cluster analysis showed that 30 batches of sample were clustered into two categories， S1-S10 were clustered into one category， and S11-S30 were clustered into other category. Principal component analysis showed that cumulative contribution rate of former two main components was 83.147%. Results of partial least squares-discriminant analysis showed that morroniside， No.5 peak and chromaticity values （L， a， b） were the difference markers affecting its quality. CONCLUSIONS： Established UPLC characteristic chromatogram is stable and feasible， and can be used to rapidly identify? ? ? ? C. officinalis and its different wine-processed products. Established chemical mode can be used to identify different wine-processed products.

KEYWORDS? ?Cornus officinalis decoction piece; Wine-processed products; UPLC; Characteristic chromatogram; Chromaticity value; Cluster analysis; Principal component analysis; Partial least squares-discriminant analysis

中圖分類號 R284 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）02-0206-08

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.02.14

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb. et Zucc.的干燥成熟果肉，始載于《神農本草經》[1]，具有補益肝腎、收澀固脫的功效，主要用于治療眩暈耳鳴、腰膝酸痛、陽痿遺精、遺尿尿頻、崩漏帶下、大汗虛脫、內熱消渴等癥[2]。2020年版《中國藥典》（一部）收載有山萸肉和酒萸肉等兩種飲片[2]。現代研究表明，山萸肉飲片長于斂汗固脫，其降血糖、抗凝血、抗心律失常作用較強;而酒制品補益肝腎作用較強，常入滋補方劑[3]。可見，山茱萸不同炮制品功效差異較大，臨床不宜混用。

2020年版《中國藥典》（一部）中記載，酒萸肉飲片的炮制方法為酒燉或酒蒸[2]。安徽、北京、云南、浙江等地多采用酒蒸，而江蘇、廣西則多采用酒燉[3]。2020年版《中國藥典》（一部）中對酒萸肉飲片的外觀性狀描述為“形如山茱萸，表面紫黑色或黑色，質滋潤柔軟，微有酒香氣”[2]。中藥成分復雜，在炮制的動態過程中，隨著飲片色澤加深，化學成分的組成與含量也隨之變化。在傳統的中藥炮制中，多以飲片外觀性狀、色澤作為炮制終點的判別指標，但主觀性較強，易導致不同產地酒萸肉飲片的質量差異較大[4-6]。

2020年版《中國藥典》（一部）對山萸肉和酒萸肉的鑒別項、檢查項、浸出物項規定均相同，未有明確區分;雖然兩者的含量測定采用同種指標成分，但以不同限度進行要求[2]。鑒于兩者顏色均較深，指標成分均為馬錢苷和莫諾苷，且酒萸肉的規定限度低于山萸肉，若存在混用情況，僅通過觀察飲片的外觀性狀、色澤，則無法較好地對兩者進行區分。目前，關于山萸肉的研究主要涉及其飲片炮制前后特征成分的含量變化[7-10]，而應用視覺分析儀客觀量化飲片外觀色澤，同時結合其特征圖譜快速鑒別的研究較少。基于此，本研究采用超高效液相色譜法（UPLC）建立山萸肉及其不同酒制品飲片的特征圖譜，同時結合色差原理測定其色度值;采用聚類分析、主成分分析、偏最小二乘法-判別分析等化學模式識別進行分析，旨在為山萸肉飲片及其不同酒制品飲片的快速鑒別及質量綜合評價提供參考。

1 材料

1.1 儀器

實驗所用儀器有：H-class 型UPLC儀（包括QSM型四元溶劑管理器、SM-FTN型樣品管理器、CH-A型高溫柱溫箱、光電二極管陣列檢測器，美國Waters公司）、TS7600型分光測色儀（深圳市三恩時科技有限公司）、XP26型百萬分之一分析天平和ME204E型萬分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）、Milli-Q Direct 8型超純水系統（德國Merck公司）、KQ-500DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、H22-X3型電陶爐（杭州九陽生活電器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

沒食子酸對照品（批號110831-201906，純度91.5%）、5-羥甲基糠醛對照品（批號111626-201912，純度99.2%）、莫諾苷對照品（批號111998-201703，純度97.4%）、馬錢苷對照品（批號111640-201808，純度99.0%）均購自中國食品藥品檢定研究院;乙腈、磷酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

10批山茱萸藥材經廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為山茱萸科植物山茱萸C. officinalis Sieb. et Zucc.的干燥成熟果實。樣品信息來源見表1。

2 方法與結果

2.1 山萸肉、酒萸肉飲片的制備

按2020年版《中國藥典》（一部）[2]“山茱萸”項下飲片炮制方法進行炮制：分別取10批山茱萸藥材各200 g，除去雜質和殘留果核，得山萸肉飲片（編號S1～S10）。取山萸肉飲片，按2020年版《中國藥典》（四部）通則“0213酒燉法或酒蒸法”[11]燉或蒸至黃酒吸盡，取出，干燥，得酒萸肉飲片（酒燉飲片編號S11～S20;酒蒸飲片編號S21～S30）。

2.2 UPLC特征圖譜的建立

2.2.1 色譜條件 以ACQUITY UPLC BEH C18（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）為色譜柱;以乙腈（A）- 0.2%磷酸水溶液（B）為流動相梯度洗脫（0～3 min，2%A→8%A;3～9 min，8%A→15%A;9～13 min，15%A→23%A;13～19 min，23%A→100%A;19～24 min，100%A→2%A）;檢測波長為260 nm;流速為0.2 mL/min;柱溫為25 ℃;進樣量為1 μL。

2.2.2 混合對照品溶液的制備 取沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、馬錢苷對照品適量，精密稱定，加80%甲醇制成上述成分質量濃度分別為51.68、61.70、50.49、48.43 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取山萸肉飲片粉末（過三號篩，下同），約0.2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，密塞，稱定質量，超聲（功率500 W，頻率40 kHz）處理30 min，取出，放冷，再次稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，以5 000 r/min離心5 min，取上清液，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 精密度考察 取“2.2.3”項下供試品溶液適量（編號S1），按“2.2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄色譜圖。以馬錢苷（4號峰）為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，6個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明方法精密度良好。

2.2.5 重復性考察 取山萸肉飲片粉末（編號S1），約0.2 g，共6份，精密稱定，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以馬錢苷（4號峰）為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，6個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明方法重復性良好。

2.2.6 穩定性考察 取“2.2.3”項下供試品溶液適量（編號S1），分別于室溫下放置0、2、4、8、10、12、16、20、24 h時按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以馬錢苷（4號峰）為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，6個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%（n=9），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.2.7 UPLC特征圖譜建立 取10批山萸肉飲片、10批酒萸肉（酒燉）飲片和10批酒萸肉（酒蒸）飲片樣品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件（2012A）》對色譜圖進行共有峰匹配，以編號為S1 的山萸肉飲片色譜圖為參照圖譜，將時間窗寬度設為0.1 min，采用多點校正法進行色譜峰匹配，得UPLC疊加特征圖譜，詳見圖1～圖3;選擇中位數法生成山萸肉、酒萸肉（酒燉、酒蒸）飲片的對照特征圖譜，詳見圖4。

2.2.8 共有峰指認 10批山萸肉飲片色譜圖中有6個共有峰，酒萸肉（酒燉）飲片和酒萸肉（酒蒸）飲片有7個共有峰;通過與混合對照品（見圖5，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析所得）比對，共指認了其中4個共有峰，分別為沒食子酸（1號峰）、5-羥甲基糠醛（2號峰）、莫諾苷（3號峰）、馬錢苷（4號峰）。考慮到各特征峰與參照峰保留時間相差太大，不同批次樣品特征圖譜中的特征峰的相對保留時間結果易產生偏差，故以馬錢苷（4號峰）為參照計算其余共有峰的相對保留時間和相對峰面積。

2.2.9 特征圖譜比較 由圖1可知，10批山萸肉飲片均未檢測到2號峰（5-羥甲基糠醛），提示2號峰為酒制后的新增成分;炮制前后飲片的圖譜中，5號峰和6號峰的規律明顯，其中5號峰在山萸肉飲片中峰面積較小、響應值較低，而在酒制品中峰面積明顯增大，提示該峰在炮制過程中含量呈上升趨勢;6號峰則相反。

2.2.10 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件（2012A）》對10批山萸肉飲片、10批酒萸肉（酒燉）飲片和10批酒萸肉（酒蒸）飲片色譜圖進行相似度評價。結果，10批山萸肉飲片、10批酒萸肉（酒燉）飲片和10批酒萸肉（酒蒸）飲片的特征圖譜與各自相應對照特征圖譜的相似度均大于0.98;同批次山萸肉飲片與不同酒制品之間圖譜的相似度較低（0.869～0.937、0.845～0.944），而同批次山萸肉飲片制備的不同酒制品飲片之間圖譜的相似度均大于0.99，表明山萸肉飲片炮制前后圖譜相似度存在一定差異，但不同酒制法炮制的飲片相似，詳見表2、表3。

2.3 山萸肉飲片及其不同酒制品色度值的測定

2.3.1 色度值測定 Lab 模式是由國際照明委員會（CIE）于1976 年公布的一種色彩模式，是CIE確定的一個理論上包括了人眼可見的所有色彩的色彩模式[12]。其中，明暗度值（L）越大表示越白，越小表示越黑;紅綠色調值（a）表示從紅色到綠色的范圍，正值為紅色方向、負值為綠色方向;黃藍色調值（b）表示從黃色到藍色的范圍，正值為黃色方向、負值為藍色方向[12]。

分別取10批山萸肉飲片、10批酒萸肉（酒燉）飲片和10批酒萸肉（酒蒸）飲片，采用相當于6 504 k自然光的D65光源，以A4白紙為背景，采用分光測色儀測得山萸肉飲片及不同酒制品飲片圖像（圖略）和山萸肉飲片（LSZ、aSZ、bSZ）、酒萸肉（酒燉）飲片（LJD、aJD、bJD）和酒萸肉（酒蒸）飲片（LJZ、aJZ、bJZ）的色度值參數，每個樣品平行測定3 次，取平均值;同時，測定A4白紙的色度值（L0、a0 、b0），根據色差公式[12]：色差值（ΔE）=（ΔL2+Δa2+Δb2）1/2;亮度差異（ΔL）=L樣品-L0。紅/綠差異（Δa）=a樣品-a0;黃/藍差異（Δb）=b樣品-b0，計算山萸肉飲片的ΔES、酒萸肉（酒燉）飲片的ΔED、酒萸肉（酒蒸）飲片的ΔEZ，結果見表4。由表4可知，10批山萸肉飲片的LSZ為25.33～31.25、aSZ為15.83～27.33、bSZ為8.92～13.58、ΔES為31.18～43.16;10批酒萸肉（酒燉）飲片的LJD為19.92～22.25、aJD為0.42～3.25、bJD為1.25～2.25、ΔED為20.02～22.49;10批酒萸肉（酒蒸）飲片的LJZ為20.08～24.83、aJZ為2.00～3.17、bJZ為2.17～3.25、ΔEZ為20.38～25.13;其中山萸肉飲片和不同酒制品飲片的色度值參數和色差值均差異較大，而不同酒制品飲片的色度值參數和色差值差異較小。

同時，根據上述公式計算山萸肉飲片與酒萸肉（酒燉）飲片的ΔESD、山萸肉飲片與酒萸肉（酒蒸）飲片的ΔESZ、酒萸肉（酒燉）飲片與酒萸肉（酒蒸）飲片的ΔEDZ。當兩個樣品之間的ΔE為6～12個色差單位（1 ΔE=1 NBS）時，其色差可被肉眼識別;當色差單位>12時，則色差顯著[13]，結果見表5。由表5可知，山萸肉飲片與酒萸肉（酒燉）飲片的ΔLSD為-9.42～-3.58、ΔaSD為-24.92～-15.00、ΔbSD為-11.33～-7.00、ΔESD為17.01～28.12，山萸肉飲片與酒萸肉（酒蒸）飲片的ΔLSZ為-8.58～-2.42、ΔaSZ為-25.08～-13.83、ΔbSZ為 -10.92～-6.08、ΔESZ為15.58～28.67，表明炮制前后山萸肉飲片的色差變化由肉眼可觀察到。酒萸肉（酒燉）飲片與酒萸肉（酒蒸）飲片的ΔLDZ為-2.17～3.00、ΔaDZ為 -0.75～2.50、ΔbDZ為0.25～1.42、ΔEDZ為1.25～3.83，表明不同酒制品之間的色差變化無法由肉眼識別。

2.3.2 方差分析 采用SPSS 20.0軟件對山萸肉飲片及不同酒制品飲片的7個特征峰的峰面積和飲片色度值進行單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。結果，山萸肉飲片與不同酒制品飲片的特征圖譜中4號和7號峰的峰面積比較，差異均無統計學意義（P>0.05）;不同酒制品飲片特征圖譜的1、2、5號峰的峰面積顯著大于山萸肉飲片，6號峰的峰面積及L、a、b值均顯著低于山萸肉飲片（P<0.05）;酒萸肉（酒蒸）飲片特征圖譜中的1、3、5號峰的峰面積和L值均顯著高于酒萸肉（酒燉）飲片（P<0.05），詳見表6。

2.4 聚類分析

將10批山萸肉飲片、10批酒萸肉（酒燉）飲片和10批酒萸肉（酒蒸）飲片的共有峰峰面積和色度值數據導入SIMCA 14.0軟件進行聚類分析，以Euclidean 平方距離為測度。結果，30批樣品可聚為2類，S1～S10聚為一類、S11～S30聚為一類，詳見圖6。

2.5 主成分分析

將10批山萸肉飲片、10批酒萸肉（酒燉）飲片和10批酒萸肉（酒蒸）飲片的共有峰峰面積和色度值數據導入SPSS 20.0軟件和SIMCA 14.0軟件進行主成分分析，以特征值>1為判斷標準[14]。特征值和方差貢獻率見表7，主成分分析得分散點圖見圖7。由表7可知，共提取2個主成分，主成分1、主成分2的累積方差貢獻率為83.147%，表明這2個主成分可作為樣品的評價指標。由圖7可知，山萸肉飲片和酒萸肉飲片區分明顯;而酒萸肉（酒燉）飲片和酒萸肉（酒蒸）飲片的部分樣品相互重疊，無法較好的區分，與聚類分析結果基本一致。

2.6 偏最小二乘法-判別分析

為進一步區分不同酒制品飲片，在主成分分析模型構建的基礎上，采用SIMCA 14.0軟件進行偏最小二乘法-判別分析，結果見圖8。由圖8可知，山萸肉飲片可與酒萸肉飲片很好的區分;不同酒制品飲片可完全區分，其中酒萸肉（酒燉）飲片位于得分圖的左上象限，酒萸肉（酒蒸）飲片位于得分圖的左下象限。

變量投影重要性指標（VIP）表示各變量在區分樣品中的貢獻程度，以VIP>1.0為指標篩選對分組具有顯著貢獻的變量[14]。采用SIMCA 14.0軟件進行偏最小二乘法-判別分析后，得到各色譜峰峰面積和色度值數據的VIP值。結果，VIP>1.0的指標有3號峰（莫諾苷）、5號峰、色度值（L、a、b），提示上述指標可作為影響山萸肉飲片及其不同酒制品飲片質量的差異標志物，詳見圖9。

3 討論

本課題組前期分別考察了不同提取溶劑（水、50%甲醇、80%甲醇、甲醇）的提取效果。結果發現，不同極性溶劑在超聲提取時對圖譜的整體峰型和色譜峰數量的影響較小，綜合考慮提取能力、不同提取溶劑圖譜的總峰面積和各色譜峰峰形，最終選擇50%甲醇為提取溶劑。同時，本課題組又對不同提取方式（超聲提取、加熱回流提取）、不同提取時間（30、45、60 min）進行了考察。結果發現，超聲提取、加熱回流提取以及不同提取時間得到的供試品特征圖譜各特征峰的總峰面積差異較小，綜合考慮操作的簡便性和資源的利用率，最終選擇50%甲醇超聲提取30 min。

本研究結果顯示，山萸肉飲片中未檢測到5-羥甲基糠醛，該成分可能為酒制后的新增成分。有研究表明，氨基化合物（蛋白質和氨基酸）與還原糖類成分在一定條件下可發生美拉德反應而生成5-羥甲基糠醛[15];同時，在中藥炮制與貯藏的動態研究中發現，隨著飲片色澤加深，5-羥甲基糠醛的含量也顯著升高[16]。這表明5-羥甲基糠醛的產生可能與山萸肉炮制過程中成分和色澤的變化具有相關性，這一現象可作為山萸肉飲片與其不同酒制品飲片的特征性差異，但仍有待相關研究進一步證實。此外，山萸肉炮制前后飲片的5、6號峰呈現出較明顯的變化，其中5號峰在山萸肉飲片中峰面積較小、響應值較低，該特征峰在炮制過程中峰面積增大，而6號峰則相反，這一特征性亦可作為山萸肉飲片及其不同酒制品飲片的鑒別點之一，其原因是山萸肉炮制后成分互相轉化還是成分受熱分解所致，尚仍有待進一步研究。

方差分析結果顯示，山萸肉飲片及其不同酒制品飲片特征圖譜中部分特征峰峰面積和部分色度值具有顯著性差異，提示山萸肉飲片經不同方法炮制前后，其化學成分含量及色度值均存在差異。聚類分析結果顯示，30批樣品可聚為兩類，即S1～S10聚為一類、S11～S30聚為一類。主成分分析結果顯示，前兩個主成分的累積方差貢獻率為83.147%，且山萸肉飲片與不同酒制品飲片可被完全區分，但不同酒制品飲片區分不明顯，提示所建立化學模式的分析和預測能力有限。偏最小二乘法-判別分析結果顯示，山萸肉飲片、不同酒制品飲片（酒燉、酒蒸）均能明顯區分，莫諾苷、5號峰和色度值（L、a、b）為影響其質量的差異標志物。

綜上所述，所建UPLC特征圖譜穩定、可行，結合色度值差異可快速鑒別山萸肉飲片及其不同酒制品飲片;所建化學模式可用于區分不同酒制品飲片，莫諾苷、5號峰和色度值參數可作為差異標志物。

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（收稿日期：2020-09-14 修回日期：2020-12-02）

（編輯：陳 宏）