腫瘤相關成纖維細胞外泌體miR-489靶向Twist1對胃癌細胞遷移、侵襲及上皮間質轉化的影響

田宇劍,吳 勝,李 偉,周城臣*,張偉杰

(1中國人民解放軍聯勤保障部隊第九○四醫院普通外科,無錫 214044;2南京大學醫學院附屬鼓樓醫院普通外科;*通訊作者,E-mail:sanyin1984@qq.com)

胃癌是中國高發的消化道惡性腫瘤,病例數占世界病例總數的一半,在惡性腫瘤致死原因中排第2位,患者5年生存率低于30%[1,2]。雖然手術切除與輔助治療能有效阻止胃癌發展,但由于大多數患者就診時已發生侵襲轉移,術后腫瘤復發的可能性較大,常常導致治療療效不佳[3]。上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是上皮細胞向有遷移能力的間質細胞轉化的過程,可以使腫瘤細胞獲得遷移、侵襲能力,是腫瘤惡性進展及腫瘤復發的重要機制之一[4,5]。微小RNA-489(microRNA-489,miR-489)是miRNA的重要成員,作為抑癌基因在多種腫瘤中低表達,其缺失與腫瘤侵襲、EMT發生密切相關。轉錄因子Twist1是腫瘤進展的重要調節因子,受到多種信號通路及因子的調控,通過承接上游信號并傳遞到下游,在細胞間聯系、腫瘤微環境、遷移、侵襲、化療耐藥、EMT等過程中均發揮重要作用[6,7]。已有研究發現,誘導miR-489缺失可通過Twist1/EMT信號通路促進大腸癌轉移[8]。腫瘤發生發展與微環境密切相關,腫瘤相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)是腫瘤微環境中最主要的間質細胞之一,其分泌的miRNA在腫瘤細胞生物學行為中扮演重要角色[9]。本研究旨在探討CAFs外泌體miR-489通過靶向Twist1對胃癌細胞遷移、侵襲及EMT的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人胃癌細胞MGC-803(貨號:XY-XB-1691)購自美國ATCC細胞庫;人胃癌CAFs:本實驗室將手術采集的新鮮胃癌組織用組織塊培養法原代培養,用差速貼壁法分離、純化后獲得胃癌CAFs,每7 d傳代一次,第3代進行細胞鑒定,取4-10代的對數生長期細胞用于本研究。DMEM培養基(貨號:KL-P0032)購自德國Merck/Sigma公司;Lipofectamine 2000轉染試劑(貨號:11668019)購自美國Invitrogen公司;外泌體純化試劑(貨號:BB-3951)購自貝博生物公司;雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(貨號:SLDL-100)購自BioAssay Systems公司;實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)試劑盒(貨號:K1002S)購自美國Promega公司;negative control-miR-489、hsa-miR-489 mimic及miR-489、Twist1、U6、GAPDH引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;結晶紫(貨號:0528-100G)購自美國Amresco公司;Matrigel基質膠(貨號:356234)購自美國BD公司;Twist1抗體、E-cadherin抗體、N-cadherin抗體、Vimentin抗體、Fibronectin抗體、GAPDH抗體(貨號:ab50581、ab231303、ab76057、ab16700、ab2413、ab181602)購自英國Abcam公司;辣根過氧化物酶標記的羊抗兔(貨號:0295G-HRP)購自美國Santa公司;恒溫培養箱(型號:MIR-162-PC/MIR-262-PC)購自日本松下公司;熒光定量PCR儀(型號:ABI 7500)為美國Applied Biosystems公司產品;顯微鏡(型號:CX31)購自日本Olympus公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及外泌體制備 MGC-803、CAFs細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中,置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。待MGC-803、CAFs細胞融合至80%左右時,用胰酶消化、傳代培養。

取對數期CAFs細胞以5×105個/孔接種于96孔培養板,分為正常對照組、mimic NC組和miR-489 mimic組,正常對照組CAFs細胞不進行轉染,mimic NC組和miR-489 mimic組CAFs細胞使用Lipofectamine 2000轉染試劑分別轉染negative control-miR-489和hsa-miR-489 mimic。

轉染后培養24 h離心收集細胞培養上清,離心去除細胞及細胞碎片,轉移上清并加入0.2倍上清液體積的外泌體純化試劑,混勻,4 ℃靜置孵育12 h,離心去上清,收集外泌體沉淀,加入100 μl PBS緩沖液重懸。

1.2.2 雙熒光素酶報告基因實驗驗證CAFs細胞中miR-489與Twist1的靶向關系 利用TargetScanHuman網站預測miR-489與Twist1的靶向關系及結合位點。構建Twist1的野生型(Twist1-WT)和突變型(Twist1-MUT)3′UTR-熒光素酶表達載體,采用脂質體轉染技術分別與negative control-miR-489共同轉入CAFs細胞中,命名為miR-489 con組;與miR-489 mimic共同轉入CAFs細胞中,命名為miR-489組。使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性,以兩者比值作為熒光素酶的相對活性。

1.2.3 qRT-PCR法檢測各組CAFs細胞外泌體中miR-489、Twist1 mRNA表達情況 使用Trizol試劑提取1.2.1中各組外泌體總RNA,逆轉錄合成cDNA,按照qRT-PCR試劑盒說明書,在熒光定量PCR儀上檢測miR-489、Twist1 mRNA表達水平,以2-ΔΔCt法表示,U6為miR-489內參基因,GADPH為Twist1內參基因。反應程序:95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,循環40次。引物序列見表1。

表1 實時定量PCR引物序列

1.2.4 蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測各組CAFs細胞中Twist1蛋白表達情況及各組MGC-803細胞中EMT相關蛋白變動情況 取對數期MGC-803細胞以1×104個/孔接種于96孔培養板,分別加入1.2.1中各組制備的外泌體重懸液50 μl,分別命名為對照組、陰性對照組和miR-489組,培養24 h,收集細胞,提取各組細胞總蛋白及1.2.1中各組CAFs外泌體總蛋白,測定蛋白濃度并定量。電泳、轉膜、封閉1 h,分別加入Twist1抗體、E-cadherin抗體、N-cadherin抗體、Vimentin抗體、Fibronectin抗體、GAPDH抗體(均1∶500),4 ℃孵育過夜,TBST洗滌,加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1∶5 000),室溫孵育1 h,化學發光法顯色,拍攝圖像并分析條帶灰度,計算目的蛋白表達水平,目的蛋白表達水平=目的蛋白灰度值/內參GAPDH灰度值。

1.2.5 Transwell法檢測各組MGC-803細胞遷移情況 用無血清培養液將對數期MGC-803細胞稀釋為2.5×105個/ml的細胞懸液,分別向Transwell小室上層加入150 μl,同時分別加入1.2.1中各組制備的外泌體重懸液50 μl,分別命名為對照組、陰性對照組和miR-489組,下室中均加入500 μl含10%胎牛血清的培養液,置于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育24 h,擦去未穿膜的細胞,4%多聚甲醛固定下層遷移細胞10 min,PBS洗滌,0.5%結晶紫染液染色20 min,PBS洗滌,使用顯微鏡在200倍鏡下隨機選取6個視野觀察拍照,統計遷移細胞數并計算平均值。

1.2.6 Transwell法檢測各組MGC-803細胞侵襲情況 用無血清培養基稀釋Matrigel基質膠(1∶8),向每個Transwell小室中加50 μl,37 ℃ 1 h凝固。后續操作均與1.2.5中檢測細胞遷移情況步驟相同,隨機選6個視野統計侵襲細胞數。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 CAFs細胞中miR-489與Twist1的靶向作用關系

在TargetScanHuman網站預測顯示,miR-489與Twist1基因存在靶向結合位點(見圖1)。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示,轉染Twist1-WT的miR-489 con組和miR-489組CAFs細胞中相對熒光素酶活性差異有統計學意義(P<0.05);轉染Twist1-MUT的miR-489 con組和miR-489組CAFs細胞中相對熒光素酶活性差異無統計學意義(P>0.05,見表2),說明miR-489與Twist1存在靶向關系。

圖1 TargetScanHuman網站預測miR-489與Twist1的靶向結合位點

2.2 各組CAFs細胞外泌體中miR-489、Twist1 mRNA及蛋白表達情況

正常對照組和mimic NC組CAFs細胞外泌體中miR-489、Twist1 mRNA及蛋白表達水平差異無統計學意義(q=0.759,0.319,0.522,均P>0.05);與對照組和mimic NC組相比,miR-489 mimic組CAFs細胞外泌體中miR-489表達水平顯著升高(q=16.697,17.456,均P<0.05),Twist1 mRNA及蛋白表達水平顯著降低(q=14.669,14.350,6.267,6.789,均P<0.05,見表3、圖2)。

表3 各組CAFs細胞外泌體中miR-489、Twist1 mRNA及蛋白表達水平比較

圖2 各組CAFs細胞外泌體中Twist1蛋白表達情況

2.3 各組MGC-803細胞遷移、侵襲情況

對照組和陰性對照組MGC-803細胞遷移、侵襲細胞數差異無統計學意義(q=3.033,1.911,均P>0.05);與對照組和陰性對照組相比,miR-489組MGC-803細胞遷移、侵襲細胞數顯著降低(q=19.675,16.641,26.378,24.467,均P<0.05,見圖3、表4)。

圖3 各組MGC-803細胞遷移、侵襲情況

表4 各組MGC-803細胞遷移、侵襲細胞數比較

2.4 各組MGC-803細胞中EMT相關蛋白表達情況

對照組和陰性對照組MGC-803細胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Fibronectin蛋白表達水平差異無統計學意義(q=0.795,1.921,1.521,2.528,均P>0.05);與對照組和陰性對照組相比,miR-489組MGC-803細胞中E-cadherin蛋白表達水平顯著升高(q=19.471,20.265,均P<0.05),N-cadherin、Vimentin、Fibronectin蛋白表達水平顯著降低(q=17.669,15.749,11.156,12.677,11.918,9.390,均P<0.05,見表5,圖4)。

表5 各組MGC-803細胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Fibronectin蛋白表達水平比較

圖4 各組MGC-803細胞中E-cadherin、N-cadherin、Vi-mentin、Fibronectin蛋白表達情況

3 討論

胃癌細胞的遷移、侵襲是導致患者經過治療后預后不佳的重要原因之一,研究發現,其發生不僅取決于腫瘤細胞本身固有的生物學行為,還受到腫瘤微環境的影響[10,11]。腫瘤微環境在腫瘤的發生發展中起重要作用。其中,CAFs是腫瘤微環境中主要的間質細胞成分,在組織完整性構建中發揮重要作用,能夠分泌生長因子、細胞因子等多種成分,通過影響腫瘤細胞的增殖、侵襲、免疫逃逸及化療耐藥等過程,在腫瘤惡性進展過程中扮演重要角色,嚴重影響患者腫瘤治療工作的順利進行[12,13]。

miRNAs是一類小分子單鏈非編碼RNA,通過識別并結合靶基因mRNA的3’非編碼區,在轉錄及轉錄后水平調控多種靶基因的表達,進而參與調節多條信號通路及腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、轉移等多種生物學過程,在腫瘤的發生發展過程中發揮重要作用[14]。研究發現,miRNAs不僅可通過在腫瘤細胞中差異表達影響腫瘤進展,還可通過在CAFs中差異表達,通過腫瘤微環境在腫瘤發生發展中起重要作用[15]。Xu等[16]研究發現,胃CAFs中的外泌體miR-139通過抑制腫瘤微環境中的MMP11表達可抑制胃癌的進展和轉移。另有研究發現,過表達miR-489可通過調控Twist1的表達抑制結腸癌干細胞表型和EMT[17]。本研究通過生物信息學分析及雙熒光素酶報告基因實驗發現,miR-489、Twist1在胃癌CAFs中存在靶向關系。進一步研究發現,上調CAFs細胞外泌體中miR-489表達水平后,Twist1 mRNA及蛋白表達水平顯著降低,且受到CAFs細胞外泌體影響的胃癌細胞MGC-803的遷移、侵襲細胞數顯著減少,提示miR-489可能通過靶向降低Twist1在CAFs細胞外泌體中的表達水平,進而抑制胃癌細胞的遷移、侵襲過程。

Twist1是與真核生物生長發育調控有關的堿性螺旋—環—螺旋家族成員,其過表達可以促進癌轉移且與人類惡性腫瘤預后不良有關,同時是EMT過程的關鍵基因,可通過EMT過程影響胃癌等腫瘤細胞的侵襲、轉移過程[18,19]。Wang等[20]研究表明,miR-15a-3p、miR-16-1-3p通過負調控Twist1可以抑制胃癌細胞的侵襲及轉移過程。本研究上調CAFs細胞外泌體中miR-489表達水平后,檢測MGC-803細胞中上皮細胞標志物E-cadherin及間質細胞標志物N-cadherin、Vimentin、Fibronectin蛋白表達水平后發現,E-cadherin蛋白水平顯著升高,N-cadherin、Vimentin、Fibronectin水平顯著降低,同時miR-489通過靶向降低EMT過程的關鍵基因Twist1的表達,可以抑制N-cadherin、Vimentin、Fibronectin表達,上調E-cadherin表達,進而抑制MGC-803細胞的EMT過程。

綜上所述,CAFs外泌體miR-489過表達可靶向抑制Twist1表達,進而抑制胃癌細胞MGC-803的遷移、侵襲及EMT過程。本研究可能有助于臨床開發胃癌治療的新靶標,通過影響腫瘤微環境改善腫瘤的遷移、侵襲行為,減少胃癌復發。