LPS 誘導仔豬腓腸肌相關microRNA在不同時間點的mRNA 表達

黃興法 ， 徐 鑫 ， 張 晶 ， 王秀英 ， 劉玉蘭 ， 汪文俊 ， 康 萍

（1.中南民族大學武陵山區特色資源植物種質保護與利用湖北省重點實驗室，湖北武漢 430074；2.武漢輕工大學動物營養與飼料科學湖北省重點實驗室，湖北武漢 430023）

隨著養殖規模的擴大， 如何降低外界環境因素對養殖業帶來的經濟損失一直是研究者關注的重點。 環境中的微生物，如細菌、真菌和病毒等均會導致仔豬在飼養過程中產生免疫應激反應，進而誘導動物炎癥。 脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分，在組織細胞中，能快速誘導促炎細胞因子的產生，進而引起炎癥反應（Irtegun 等，2016）。miRNA 是一種約含22 個核苷酸的內源性非編碼單鏈小RNA 分子，在大多數真核生物中存在高度保守性 （Geng 等，2014）。 許多哺乳動物miRNAs 可以調節免疫反應和炎癥反應 （Qiu 等，2019；O"connell 等，2012）。 腓腸肌是小腿后面淺層的大塊肌肉，其組織中的蛋白酶體標志物、氧化應激、炎癥、線粒體呼吸鏈（MRC）活性、耗氧量等指標一直被廣泛研究（Barreiro 等，2016）。 雖然目前對LPS 刺激后誘導的機體組織編碼基因關鍵信號通路研究很多， 但對相關非編碼基因在炎癥反應中調控的研究并不多。因此，本試驗旨在研究仔豬腓腸肌相關miRNA 在發生炎癥斷奶仔豬的基因表達情況，為后續研究miRNA 在肌肉組織中的炎癥調控作用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計 選擇體重為（7.1±0.9）kg 的杜×長×大斷奶仔豬42 頭，飼喂基礎飼糧14 d 后，設置對照組（注射 LPS 之前 0 h）和 LPS 組（注射 LPS 之后 1、2、4、8、12、24 h）。分別按體重 100 μg/kg 腹腔注射生理鹽水和LPS，然后屠宰取腓腸肌樣品待測。

1.2 試驗飼糧 飼糧配方采用玉米-豆粕型基礎飼糧，參照NRC（1998）仔豬營養需要進行配制，具體組成及營養水平見表1。

1.3 試驗材料 本試驗注射LPS 的血清型、來源、配制方法與汪洋等（2019）的一致。

表1 基礎飼糧組成及營養水平（風干基礎）

1.4 飼養管理 動物飼養試驗在動物營養與飼料科學湖北省重點實驗室進行。 本試驗飼養管理方法參照陳會甫等（2018）的方法進行。

1.5 測定指標與方法 用 RNAiso Plus 試劑（#9108，TaKaRa） 提取腓腸肌組織總 RNA。 根據PrimeScriptRT Reagent Kit with gDNA Eraser（#RR047A，TaKa-Ra）說明書進行基因組 DNA 去除，并用mirVanaTMqRT-PCR 引物套裝（吉瑪基因，上海）和 SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）qPCR Kit （#RR420A，TaKaRa） 進 行 成 熟miRNA 定量檢測。 以 U6 為內參，并參照 Livak 等（2001）的 2-△△CT法進行計算。

1.6 統計學分析 試驗采用SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析和Duncan’s 多重比較，結果采用“平均值±標準誤”表示，P ＜0.05 表示差異顯著。

2 試驗結果

LPS 刺激對斷奶仔豬腓腸肌miRNA 相關基因表達量的影響結果見表2。 與對照組相比，LPS刺激后2 h，仔豬腓腸肌miRNA-10b 的mRNA 表達量顯著降低 （P ＜ 0.01）；LPS 刺激后 1 h， miRNA-1 和miRNA-206 的mRNA 表達量顯著降低（P ＜ 0.01）；但 LPS 刺激后 miRNA-133a 的 mRNA表達量無顯著變化（P ＞ 0.05）。

3 討論

給斷奶仔豬注射一定劑量的LPS 是建立仔豬炎癥的良好模型（Zhu 等，2013）。研究表明，LPS刺激后4 h 可誘導肌肉炎性細胞因子大量表達（李先根等，2019）。 還有研究報道，先天性免疫細胞可以處于不同的狀態， 具有不同程度的促炎和抗炎表型（Hanke 等，2013；Stephanie 等，2009），并伴隨著對宿主防御和炎癥的不同后果（Marrotte等，2010）。 汪洋等（2019）的研究也表明，LPS 刺激激活了炎癥信號通路， 使炎性細胞表達量顯著上調，并在不同時間點，這些基因呈現先上升后逐漸下降的變化。 隨著現在對miRNA 的深入關注，發現不同的miRNA 對機體組織炎癥有著不同的調控功能。 例如：通過有效下調miRNA-DAB2IP 可以增強癌細胞的運動和侵襲性，促進NF-κB 信號的激活， 進而促進促炎癥和促血管生成因子的表達（Bellazzo 等，2018）。 miRNA-19b 通過抑制胸腺基質淋巴生成素下調小鼠哮喘模型的STAT3 信號來減少氧化應激程度（Ling 等，2017）。 miRNA-125b 上調可激活NF-κB 途徑促進類風濕關節炎（RA）炎癥（Zhang 等，2017）。 此外，炎癥相關的miRNA 在牛乳中的表達水平受到乳腺炎的影響，牛奶中的miRNA 有可能作為牛乳腺炎的生物標志物（Lai 等，2017）。 以上研究表明，機體內這些小分子RNA 雖然不能編碼蛋白質，但是其也能夠調控機體的炎癥相關信號通路。 因此本試驗的目的是研究LPS 處理前后不同時間點不同miRNA的表達，為后續研究miRNA 在肌肉組織中的炎癥調控作用提供科學依據。

表2 LPS 處理前后不同時間點miRNA 表達

miRNA-10b 是最先被證明在癌癥中有異常表達的 miRNA 之一（Mal 等，2017）。 迄今為止，已有超過100 項關于miRNA-10b 與18 種癌癥轉移的研究。 Sheedy 和 Medarova（2018）認為 miRNA-10b 作為癌癥治療和診斷靶點的潛力是非常重要的。此外，miRNA-10b 還與骨形成呈正相關，可促進體外成骨和抑制體外成脂（Li 等，2018）。 在本研究中，LPS 刺激 2 h 后，miRNA-10b 表達顯著降低， 說明miRNA-10b 可能對動物早期免疫應激后起到了負調控的作用。miRNA-1 是最先被證明在肌肉細胞衍生物中特異表達的miRNA 之一（Nicholas 等，2005）。 截止到目前，已有 50 余項關于miRNA-1 在肌肉相關信號通路調控的研究。Cai 等（2015）認為，miRNA-1 與轉錄后調控多種與心肌電活動相關的離子通道和蛋白有關。此外，miRNA-1 還對心肌細胞肥大、細胞外基質沉積以及心臟重塑至關重要 （Luo 等，2018）。 在本研究中，LPS 刺激 1 h 后， 腓腸肌中 miRNA-1 表達顯著降低， 說明miRNA-1 可能對動物早期免疫應激也起到了負調控的作用。miRNA-206 是最先被證明在小鼠骨骼肌中有異常表達的miRNA 之一（Mccarthy 等，2007）。迄今為止，已有 20 余項關于miRNA-206 在肌肉組織中的研究。 Zhang 等（2019） 認為，miR-206 在骨骼肌生長發育調控中非常重要。此外，miRNA-206 還與乳腺癌有關，可作為預測乳腺癌患者預后的重要指標 （Xing 等，2016）。 在本研究中，LPS 刺激 1 h 后， 腓腸肌中miRNA-206 表達顯著降低， 說明 miRNA-206 可能對動物早期免疫應激起到了負調控的作用。miRNA-133a 首次被證明是在成人骨骼肌中有異常表達的 miRNA 之一（Mccarthy 等，2007）。 迄今為止， 已有200 余項關于miRNA-133a 在肌肉中差異表達的研究。Ramos 等 （2018）認為，miRNA-133a 通過耗盡肌肉細胞內儲存并釋放其對靶基因表達的抑制作用，潛在地介導運動的生理適應。此外，miRNA-133a 還與腰椎骨密度呈負相關，通過促進破骨細胞分化參與了絕經后骨質疏松癥的調節（Zhong 等，2018）。 在本研究中，LPS 刺激 1 h后，miRNA-133a 無顯著變化，說明在仔豬應激早期可能沒有參與機體的炎癥調控。 綜上， 在本試驗中， 通過建立仔豬LPS 炎癥損傷模型顯示，仔豬腓腸肌組織中的 miRNA-10b、miRNA-1、miRNA-206 的基因表達量均顯著下調， 但miRNA-133a 的基因表達量無顯著變化，這表明在LPS 刺激后同一個miRNA 在不同機體組織炎癥反應中的表達也不一致。

4 結論

LPS 刺激下誘導腓腸肌相關基因miRNA-10b、miRNA-1 和 miRNA-206 在不同時間點均有顯著降低，表明這些miRNA 可能參與了肌肉炎癥早期相關信號通路的調控，可為后續miRNA 在肌肉組織中具體調控作用提供科學依據。