復合菌固態發酵對雜粕營養價值的影響

涂 瑞， 曾 鈺， 彭忠利， 高彥華， 吳華卓， 柏 雪

（西南民族大學畜牧獸醫學院，青藏高原動物遺傳資源保護與利用重點實驗室，四川成都610041）

目前，我國飼用蛋白質資源嚴重短缺（劉長松等，2015），而菜籽粕和棉籽粕產量高、價格低廉，而且蛋白質含量均在35%以上 （余勃等，2009），是潛力較大的蛋白質飼料資源。 但菜籽粕和棉籽粕中含有硫葡萄糖甙、單寧、游離棉酚、植酸等抗營養因子（Khattab 等，2010），且蛋白質分子較大（Aider 等，2011），纖維物質含量較高，不僅影響其作為飼料原料的安全性、適口性和營養價值，還極大地限制了在動物生產中的應用。 發酵飼料的興起和發酵工藝的完善為該問題提供了解決思路。國內外主要采用物理法、 化學脫毒和微生物發酵等方法降低棉籽粕和菜籽粕中的抗營養因子（Yang 等，2001），物理法和化學脫毒因效果單一、成本高而難以推廣應用， 而微生物發酵法不僅安全、脫毒率高，而且成本低、工藝簡單。微生物發酵不僅能降低抗營養因子和霉菌毒素的含量， 還能提高其營養價值，將植物蛋白轉化為菌體蛋白，降低肽鏈長度，平衡氨基酸的組成（付敏等，2013），改善適口性，提高消化酶活性，調節胃腸道微生態平衡，提高消化利用率，降低生產成本，對緩解我國蛋白飼料匱乏和促進畜牧業的長遠發展具有重要意義（吳正可等，2018；Liu 等，2008）。

近年來， 研究者利用單一菌種對棉籽粕或菜籽粕固態發酵做了大量的研究， 發現單一菌種對其營養價值的改善效果不明顯， 且不便在實際生產中推廣應用。 而復合菌固態發酵能產生更多的酶， 達到單一菌種所不具備的協同效果與互補作用（Madeira 等，2012）。研究發現，黑曲霉能產生多種酶，是重要的工業酶制劑生產菌種，不僅酶的產量、活性較高，而且生長旺盛、發酵周期短，是美國FAD 認證的安全菌種（Gamarra 等，2010；Schuster等，2002）；米曲霉能有效地將淀粉、纖維素降解為易被利用的單糖等物質，合成菌體蛋白，但米曲霉只產生外切水解肽酶，對于蛋白質的利用有限（高曉梅等，2014）； 而枯草芽孢桿菌能夠產生活性較強的蛋白質內切肽酶、α-淀粉酶和脂肪酶 （劉曉艷等，2018）， 同時還能分泌降解飼料中復雜碳水化合物的酶，不僅能夠提高飼料中氨基酸含量，還能彌補其他菌種的不足（張玉誠等，2016）。目前利用黑曲霉、 米曲霉和枯草芽孢桿菌進行混合固態發酵的研究鮮有報道。鑒于此，本試驗以棉籽粕和菜籽粕為原料，利用復合菌進行固態發酵，探討固態發酵對雜粕營養價值和安全性的影響， 為優質蛋白質飼料的研發及棉籽粕和菜籽粕的合理利用提供實用技術和基礎數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 發酵底物：棉籽粕、菜籽粕，由四川新通達生物飼料科技有限公司提供。

發酵菌種： 復合菌種由黑曲霉（CICC2139AS3.324，1.10×1010～ 1.15×1010cfu/g）、米曲霉（CICC2329 滬釀 3.042，1.10×1010～ 1.14×1010cfu/g，）、枯草芽孢桿菌（BNCC188080，1.90×1010～2.10×1010cfu/g）組成。 黑曲霉、米曲霉由濟寧玉園生物科技有限公司提供； 枯草芽孢桿菌由北京北納創聯生物技術研究院提供。

1.2 試驗設計 在特定條件下通過復合菌種對雜粕進行固態發酵， 采用多點取樣法分別采集發酵前后的樣品，以相同的方法測定營養成分、抗營養因子、氨基酸含量、霉菌毒素含量和酶活性，對發酵雜粕的營養價值和生物安全進行評定。

1.3 發酵方法及條件 參考本課題組前期優化的試驗條件，在四川新通達生物飼料科技有限公司進行發酵，發酵混合物按以下條件混合：棉籽粕:菜籽粕=1:1；料水比=1:1；黑曲霉:米曲霉:枯草芽孢桿菌=5:5:2；接種量：5.92×107～ 6.26×107cfu/g。

將發酵混合物混合均勻后平鋪在恒溫發酵床（專利申請號：CN201920581366.0 已授權） 中，（35±2）℃靜置發酵 4 d，每天翻料一次。

1.4 樣品的采集與測定

1.4.1 樣品的采集 將發酵底物混合均勻后，置于發酵床上，隨機選擇10 個點采集混合樣，迅速帶回實驗室，65 ℃烘干，粉碎過40 目篩，保存待測。 在發酵結束后，在每個發酵床隨機選擇10 個點采集發酵樣品，低溫保存迅速帶回實驗室，65 ℃烘干，粉碎過40 目篩，封裝標號用于常規營養成分和霉菌毒素的測定。

1.4.2 常規營養成分的測定 干物質、粗蛋白質、粗灰分、鈣和磷的含量參照張麗英（2003）的方法測定， 中性洗滌纖維、 酸性洗滌纖維的含量參照Van Soest 等（1991）采用濾袋法進行測定；總能采用德國IKA 等溫氧彈量熱儀（C6000）測定。

1.4.3 氨基酸含量的測定 氨基酸含量參照 《飼料中含硫氨基酸的測定 離子交換色譜法》（GB/T 15399-2018）中氧化水解法測定。

1.4.4 霉菌毒素含量的測定 黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量分別參照《飼料中黃曲霉毒素B1 的測定 酶聯免疫吸附法》（GB/T 17480-2008）、《飼料中玉米赤霉烯酮的測定》（GB/T 19540-2004）、《食品安全國家標準 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y定》（GB/T 5009.111-2016）中的方法測定。

1.4.5 抗營養因子含量的測定 游離棉酚、單寧、植酸含量分別參照《飼料中游離棉酚的測定方法》（GB/T 13086-1991）、《飼料中單寧的測定 分光光度法》（GB/T 27985-2011）、《食品安全國家標準食品中植酸的測定》（GB 5009.153-2016） 中的方法測定。

1.4.6 酶活性的測定 蛋白酶活性參照 《蛋白酶活力測定法》（SB/T 10317 ～ 1999） 中福林酚法進行測定；α-淀粉酶活性和脂肪酶活性分別采用南京建成生物工程研究所的α-淀粉酶試劑盒和脂肪酶試劑盒測定，按說明書操作進行測定，操作室室內溫度在20 ℃左右。

1.5 數據統計分析 原始數據經Excel 2016 初步整理后，調用SPSS 24.0 軟件中成對樣本t 檢驗來完成配對樣本平均數的差異顯著性檢驗， 結果以 “平均值±標準差” 表示，P ＜0.05 表示差異顯著，P ＞0.05 表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 復合菌固態發酵對雜粕營養組成的影響 由表1 可知，與發酵前相比，發酵后干物質含量無顯著變化（P ＞ 0.05）；發酵后粗蛋白質、粗灰分、鈣、磷含量分別顯著提高了15.19%、11.67%、18.18%、22.43%，中性洗滌纖維含量顯著降低了15.47%；酸性洗滌纖維含量和總能無顯著變化（P ＞0.05）。

2.2 復合菌固態發酵對雜粕氨基酸含量的影響由表2 可知， 與發酵前相比， 發酵后除谷氨酸外（P ＞ 0.05），總氨基酸、必需氨基酸、非必需氨基酸及其他種類的氨基酸含量均顯著提高 （P ＜0.05），其中賴氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和總必需氨基酸含量分別提高了30.93%、23.97%、22.07%、20.56%和21.36%，胱氨酸有顯著提高的趨勢（P =0.053），精氨酸含量降低，但差異不顯著（P ＞ 0.05）。

表1 固態發酵雜粕營養成分的變化（干物質基礎）

表2 固態發酵雜粕氨基酸含量的變化（干物質基礎） %

2.3 復合菌固態發酵對雜粕霉菌毒素和抗營養因子含量的影響 由表3 可知，與發酵前相比，發酵后黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的含量分別降低了 21.25%和 28.56%（P ＜ 0.001）， 而脫氧雪腐鐮刀菌烯醇在發酵后未檢出。與發酵前相比，發酵后游離棉酚、 單寧和植酸的含量分別降低了51.51%、21.21%和 23.22%（P ＜ 0.05）。

表3 固態發酵對雜粕霉菌毒素和抗營養因子含量的影響

2.4 復合菌固態發酵對雜粕酶活性的影響 由表4 可知，與發酵前相比，發酵后蛋白酶活性顯著提高了 115.21%（P ＜ 0.001）， 脂肪酶活性有顯著提高的趨勢（P =0.083），而淀粉酶活性無顯著變化（P ＞ 0.05）。

表4 固態發酵對雜粕酶活性的影響

3 討論

3.1 復合菌固態發酵對雜粕營養組成的影響微生物發酵是改善棉籽粕和菜籽粕營養價值的有效途徑之一。 吳正可等（2018）利用篩選出的嗜酸乳桿菌與釀酒酵母、 枯草芽孢桿菌對菜籽粕進行混菌發酵，發酵后菜籽粕呈黃褐色蓬松狀，粗蛋白質含量提高了18.30%。 孫林等（2017）研究發現，菜籽粕經混菌發酵后粗蛋白質的含量由36.20%提升到42.50%，顯著提高了多肽的含量，降低了植酸和單寧的含量。 Sun 等（2012）通過添加枯草芽孢桿菌和木瓜蛋白酶發酵棉籽粕， 結果表明發酵顯著提高了粗蛋白質和粗灰分的含量， 顯著降低了粗脂肪和粗纖維的含量。本試驗結果表明，發酵4 d 后粗蛋白質由43.06%提升至49.60%，提高了15.19%，與豆粕的蛋白水平相當，中性洗滌纖維含量降低了15.47%，與上述研究結果一致。 可能是發酵過程中微生物將雜粕中的粗蛋白質轉化為動物更易利用的菌體蛋白等物質， 同時也消耗了碳水化合物，造成發酵雜粕中干物質的損失，出現了蛋白質的“濃縮效應”（吳正可等，2018），最終導致發酵雜粕粗蛋白質含量的升高。 發酵后發酵雜粕的粗灰分提高了11.67%，可能是發酵過程中微生物利用了雜粕中的有機物， 使得粗灰分的相對含量升高，與Chi 等（2016）的研究結果一致。從形態學觀察，雜粕經過4 d 的發酵后，表面由光滑變得疏松多孔，且散發著濃郁的香味?？赡苁俏⑸锓置诘拿笇w維結構造成破壞， 這也是發酵后纖維物質含量降低的重要原因之一， 而疏松多孔的結構也增加了消化酶的接觸面積 （Gilani 等，2005），使得雜粕發酵效果更好，更有利于動物的消化吸收（付敏等，2013）。

研究表明， 黑曲霉和枯草芽孢桿菌都具有良好的產植酸酶能力，通過植酸酶水解植酸，將其中的植酸磷釋放出來供動物吸收， 不僅能降低植酸的抗營養作用，還能減少無機磷的添加。本試驗中雜粕發酵后磷含量提高了22.43%，而植酸的含量降低了23.22%，與鮑振國（2013）利用枯草芽孢桿菌對棉籽粕進行固態發酵，總磷含量顯著提高，植酸含量顯著降低的結果一致。 樊春光（2013）通過復合菌對豆粕進行固態發酵， 結果發現鈣含量由0.32%提升至0.37%， 總磷含量由0.62%提升至0.68%， 本試驗中發酵雜粕的鈣磷含量分別為0.39%和1.31%，鈣含量與發酵豆粕相當，而總磷含量約為發酵豆粕的兩倍。 因此發酵雜粕對日糧中鈣磷的缺乏起到了很好的補充作用， 可減少無機磷的添加，降低生產成本，同時發酵過程中產生的酶系及多肽類物質還會促進機體對鈣磷的吸收（顧斌等，2011）。

3.2 復合菌固態發酵對雜粕氨基酸組成的影響微生物發酵可將不易被機體吸收的大分子物質降解為小分子肽、游離氨基酸和低聚糖等，此外發酵底物中留存有大量消化酶、維生素、氨基酸和未知促生長因子， 從而改善雜粕的營養價值和飼用價值（Dai 等，2017）。 付敏等（2013）利用枯草芽孢桿菌、黑曲霉、白地霉對菜籽餅進行固態發酵，結果表明，隨著發酵時間的延長，游離氨基酸呈線性增加，賴氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的含量分別提高了22.73%、20.39%和 20.51%。 王曉玲等（2016）利用枯草芽孢桿菌ST ～141 和釀酒酵母N5 對棉籽粕進行混菌固態發酵，48 h 后氨基酸總量和必需氨基酸含量分別增加了22.20%和28.40%。 張夢媛等（2019）研究發現，毛霉與魯氏酵母發酵豆粕后，游離氨基酸含量增加了6.69 倍，總氨基酸含量提高了22.90%，提高了豆粕的營養價值。本試驗中，雜粕經復合菌固態發酵后，除谷氨酸和精氨酸外，其余氨基酸、總氨基酸、總必需氨基酸含量均不同程度地升高，與前人研究結果一致。說明雜粕經過復合菌固態發酵后，氨基酸組成的含量更高，組成更合理，更有利于在實際生產中推廣應用。

3.3 復合菌固態發酵對雜粕霉菌毒素和抗營養因子含量的影響 吳正可等（2018）發現，混菌固態發酵能有效地降低菜籽粕中硫苷的含量， 降解率可達30.73%；胡永娜等（2012）通過枯草芽孢桿菌、 植物乳桿菌和啤酒酵母三種菌組合對菜籽粕進行發酵，硫代葡萄糖甙、惡唑烷硫酮、單寧、植酸降解率分別為93.44%、99.99%、34.86%、18.15%。王曉玲等（2016）利用枯草芽孢桿菌和釀酒酵母對棉籽粕進行固態發酵，48 h 后游離棉酚的降解率為48.5%。 本試驗中，發酵雜粕中游離棉酚、單寧和植酸的含量分別降低了51.51%、21.21%和23.22%，與上述研究結果基本一致。 表明復合菌固態發酵能有效降低雜粕中的抗營養因子， 對雜粕的營養水平和適口性具有一定的改善作用。

在實際生產中， 飼料廠和大型養殖場在飼料原料收集和發酵等方面都是處于開放環境， 對發酵條件并沒有嚴格控制，除了所挑選的菌種，環境中的能產生霉菌毒素的菌株也可能參與了發酵過程，威脅生物安全。金佳佳等（2019）以香豆素作為唯一氮源，從豆類發酵食品、土壤、動物腸道及其內容物中篩選出一株具有黃曲霉毒素B1降解能力的菌株，降解率可達90.70%。 劉盼等（2018）從土壤中篩選出一株具有高效降解玉米赤霉烯酮的枯草芽孢桿菌（L09），經過24 h 發酵后上清液對玉米赤霉烯酮的降解率達到了96%。 吳娛等（2016）研究發現，不同初始質量濃度的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇經米曲霉 As-W.6 發酵7 d 后， 降解率均在35%以上。 本試驗測定三種常見飼料源霉菌毒素在發酵前后的變化，發現黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的含量降低了21.25%和28.56%，而脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量低于檢出限 （0.2 mg/kg）。 《飼料衛生標準》（GB 13078-2017）中對黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇給出的限量分別是 30.00 、1000 μg/kg 和 5.00 mg/kg， 雜粕發酵前后霉菌毒素的含量均低于飼料衛生標準。 由于本試驗選取的雜粕 （棉籽粕和菜籽粕）中所含有的霉菌毒素的含量相對較低，發酵后相應的降解率也較低， 但通過復合菌固態發酵對降低以上三種霉菌毒素仍有顯著效果， 可進一步保障飼料安全。

3.4 復合菌固態發酵對雜粕酶活性的影響 微生物在生長和發酵的過程中會分泌大量的酶類，可降解底物中的蛋白質、纖維等大分子物質，使之更容易被動物吸收利用（張夢媛等，2019）。和小黑（2014）研究發現，發酵棉籽粕中含有豐富的淀粉酶和蛋白酶。本試驗中，發酵雜粕中蛋白酶和脂肪酶分別提高了115.21%和8.47%， 脂肪酶雖有一定的提高，但差異不顯著。這與廖天江（2018）利用黑曲霉對沙棘籽渣進行固態發酵， 其終產物蛋白酶活性提高705.95%的結果基本一致。 劉慧菊等（2019）研究發現，枯草芽孢桿菌、黑曲霉、植物乳桿菌均能產生一定量的蛋白酶， 其酶活力大小依次為：枯草芽孢桿菌＜黑曲霉＜植物乳桿菌。

4 結論

通過復合菌對雜粕進行固態發酵， 有效地降低了抗營養因子及霉菌毒素含量， 增加了粗蛋白質、鈣、磷的含量，同時雜粕中各氨基酸含量也不同程度的提高， 雜粕的營養價值和飼喂價值得到有效改善。