長(zhǎng)鏈非編碼RNA CCHE1在胰腺導(dǎo)管腺癌中的表達(dá)及臨床意義

邵慶亮，臧輝，郭恩玲，張志強(qiáng)

·論著·

長(zhǎng)鏈非編碼RNA CCHE1在胰腺導(dǎo)管腺癌中的表達(dá)及臨床意義

邵慶亮，臧輝，郭恩玲，張志強(qiáng)

110016 沈陽(yáng)，遼寧省人民醫(yī)院膽胰外科

檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼 RNA（lncRNA）CCHE1 在胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）細(xì)胞和組織中的表達(dá)，探討 lncRNA CCHE1 與 PDAC 臨床病理特征及預(yù)后間的關(guān)系。RT-PCR 檢測(cè) PDAC 組織及配對(duì)癌旁組織以及 PDAC 細(xì)胞和胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞中 lncRNA CCHE1 的表達(dá)；利用單因素方差分析探討 lncRNA CCHE1 與 PDAC 患者臨床病理特征之間的關(guān)系；利用生存曲線分析 lncRNA CCHE1 與 PDAC 患者術(shù)后 5 年生存率的關(guān)系；利用 Cox 風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析 lncRNA CCHE1 與 PDAC 患者預(yù)后的關(guān)系。lncRNA CCHE1 在 PDAC 組織和細(xì)胞中均呈過表達(dá)；lncRNA CCHE1 的表達(dá)與 PDAC 的分化程度以及 TNM 分期密切相關(guān)（< 0.05）；lncRNA CCHE1 高表達(dá)的 PDAC 患者術(shù)后無(wú)病生存時(shí)間和總生存時(shí)間均低于低表達(dá)的患者，lncRNA CCHE1 高表達(dá)是 PDAC 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。lncRNA CCHE1 在 PDAC 中表達(dá)升高，與 PDAC 的分化程度、TNM 分期以及生存時(shí)間及預(yù)后相關(guān)。

lncRNA CCHE1； 胰腺導(dǎo)管腺癌； 預(yù)后； 生存

胰腺癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤[1]，也是我國(guó)癌癥死亡的主要原因之一，其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。在所有的胰腺癌中，胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）約占 90%[2]。PDAC 因其早期診斷率低，惡性程度高，容易對(duì)傳統(tǒng)治療手段產(chǎn)生耐藥，所以治療效果差[3]。雖然在過去的幾十年里，人們?cè)谝认侔┑难芯可细冻隽司薮蟮呐ΓM(jìn)展期胰腺癌的存活率并沒有明顯提高。臨床實(shí)踐中，TNM 分期仍然是對(duì)患者進(jìn)行分層、制定治療方案和推測(cè)預(yù)后的最可靠工具。但是相同 TNM 分期、接受相同治療的 PDAC 患者生存結(jié)局可能存在顯著差異[4]。為了改善預(yù)后，有必要尋找可靠的分子標(biāo)志物，進(jìn)而識(shí)別需要重點(diǎn)隨訪和治療的高危患者。

長(zhǎng)鏈非編碼 RNA（long noncoding RNAs，lncRNA）是一種長(zhǎng)度大于 200個(gè)核苷酸的 RNA 轉(zhuǎn)錄本，其編碼蛋白質(zhì)的能力較弱[4]。但其在基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后修飾中發(fā)揮重要作用，廣泛參與染色體重構(gòu)、細(xì)胞分化以及免疫應(yīng)答[5]。目前已有 lncRNA 參與 PDAC 發(fā)生發(fā)展的相關(guān)研究報(bào)道：lncRNA SOX2OT可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖[6]，lncRNA NORAD 通過誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移等[7]。

本研究中，我們應(yīng)用 RT-PCR 檢測(cè) lncRNA宮頸癌高表達(dá) 1（cervical carcinoma high-expressed 1，CCHE1）在 PDAC 組織和癌旁組織以及其在胰腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況，并分析其與 PDAC 患者臨床病理數(shù)據(jù)的相關(guān)性，為 PDAC 預(yù)后評(píng)估提供新的潛在分子標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本 本研究方案經(jīng)醫(yī)院道德與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，所用PDAC 組織及癌旁組織選取 2008 年 1 月 – 2015 年 12 月于我院行手術(shù)治療患者的組織標(biāo)本，共計(jì) 90 例。入組患者在我院確診為 PDAC 并行根治性切除術(shù)，所有患者腫瘤組織及配對(duì)癌旁組織新鮮取材，癌旁組織距腫瘤邊緣 2 cm 以上，避免腫瘤中心明顯鈣化或壞死部分；標(biāo)本獲取后放入凍存管并立即保存于液氮中，備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。所有患者均未接受術(shù)前放化療，且無(wú)其他腫瘤病史及器官重大疾病史。電話隨訪（最長(zhǎng)隨訪時(shí)間 72 個(gè)月，失訪 5 人）記錄預(yù)后生存資料：無(wú)病生存時(shí)間（disease-free survival，DFS），總生存時(shí)間（overall survival，OS）。共納入：男性53 例，女性 37 例；TNM 分期，I 期 25 例，II 期 18 例，III 期 45 例，IV 期 2 例；胰頭癌患者 34 例行標(biāo)準(zhǔn)胰十二指腸切除術(shù)，14 例胰腺中段占位行胰腺中段切除，42 例胰尾占位行胰體尾切除聯(lián)合脾切除。隨訪終點(diǎn)時(shí)間為死亡或本研究截止日，具體如表 1 所示。

1.1.2 細(xì)胞 胰腺癌細(xì)胞系 AsPC-1、HPAC、BxPC-3、Panc-1和正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系 HPDE6-C7取自遼寧省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 培養(yǎng)基 RPMI1640 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；10% 胎牛血清購(gòu)自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；DMEM 培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó) Gibico 公司；CO2無(wú)菌培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó) Thermo 公司。

1.2 方法

采用TRIzol 法提取病理標(biāo)本和細(xì)胞中的總RNA，并檢測(cè) RNA 的純度及濃度。以 U6 作為內(nèi)參進(jìn)行相對(duì)定量，每組設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔。lncRNA CCHE1 的上游引物序列為 5' TCACAGCCTATTG ACCTCT 3'，下游引物序列為 5' GAGCAGCATACA GACATCTA 3'；U6 的上游引物序列為 5' TTATG GGTCCTAGCCTGAC 3'，下游引物序列為 5' CAC TATTGCGGGCTGC 3'。采用 2-△△Ct法計(jì)算兩者的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

表1 患者特征和單變量分析（n = 90）

2 結(jié)果

2.1 lncRNA CCHE1 在 PDAC 組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平

RT-PCR 結(jié)果顯示，相對(duì)癌旁組織，lncRNA CCHE1在 PDAC 組織中表達(dá)水平為 2.32 ± 0.53，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05，圖 1A）。而 lncRNA CCHE1 在人胰腺癌細(xì)胞系 AsPC-1、HPAC、BxPC-3、Panc-1 中的相對(duì)表達(dá)水平分別為 2.587 ± 0.285、2.756 ± 0.388、3.410 ± 0.398、3.09 ± 0.29，較胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞 HPDE6-C7 中的 lncRNA CCHE1 的表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05，圖 1B）。

lncRNA CCHE1 相對(duì)表達(dá)水平Relative lncRNA level(lncRNA CCHE1/U6)4 3 2 1 0 lncRNA CCHE1 相對(duì)表達(dá)水平Relative lncRNA level(lncRNA CCHE1/U6)4 3 2 1 0 PDAC AdjacentA AsPC-1 HPAC BxPC-3 Panc-1 HPDE6-C7B

Figure 1 Comparison of lncRNA CCHE1 expressions between PDAC cells and tissues (A: The expression of lncRNA CCHE1 in PDAC tissue and adjacent tissue; B: The expression of lncRNA CCHE1 in PDAC and ductal epithelial cells of the pancreas cells)

表 2 lncRNA CCHE1 表達(dá)與臨床病理特征

2.2 lncRNA CCHE1 的表達(dá)水平同 PDAC 患者臨床病理特征關(guān)系

lncRNA CCHE1 在 PDAC 組織中表達(dá)的均數(shù)為 2.32，將表達(dá)水平高于 2.32 的患者歸為 lncRNA CCHE1 高表達(dá)組，共包括 46 名患者（51.1%），將表達(dá)水平低于 2.32 的患者作為 lncRNA CCHE1 低表達(dá)組，共包括患者 44 名（48.9%）。單因素 ANOVA 分析 lncRNA CCHE1 表達(dá)與 PDAC 臨床病理特征的關(guān)系。表 2 顯示 lncRNA CCHE1 的表達(dá)水平與 PDAC 的分化程度和 TNM 分期密切相關(guān)（< 0.05）。lncRNA CCHE1 表達(dá)與其他臨床病理特征（性別、年齡、腫瘤大小）不相關(guān)（> 0.05）。

2.3 lncRNA CCHE1 的表達(dá)水平與 PDAC 預(yù)后相關(guān)性

本研究共隨訪 90 例患者，術(shù)后 5 年內(nèi)死亡病例 69 例（死亡率 76.66%），中位 DFS 25.73 個(gè)月，OS 30.96 個(gè)月。lncRNA CCHE1 高表達(dá)組患者 46 例，DFS 16.87 個(gè)月，OS 23.24 個(gè)月；lncRNA CCHE1 低表達(dá)組患者 44 例，DFS 35.00 個(gè)月，OS 39.02 個(gè)月；兩組之間具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（< 0.01，表1）。

Kaplan-Meier 生存曲線顯示 lncRNA CCHE1 表達(dá)水平越高，患者的 DFS 越短（Chi-Square = 10.38，= 0.01，圖 2A）、OS 越短（Chi-Square = 9.79，= 0.02，圖 2B），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Cox 多因素分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA CCHE1 表達(dá)與 PDAC 患者 DFS、OS 密切相關(guān)，HR 分別為 1.68（1.46 ~ 1.97），1.67（1.47 ~ 1.98），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05，表 3），提示 lncRNA CCHE1 的高表達(dá)有可能作為 PDAC 的預(yù)后判斷指標(biāo)。

3 討論

PDAC 是一種具有高侵襲性的惡性腫瘤，由于診斷延遲、易早期轉(zhuǎn)移和對(duì)大多數(shù)細(xì)胞毒性藥物耐藥導(dǎo)致預(yù)后極差[8]。因此，建立新的診斷、預(yù)后和治療相關(guān)生物標(biāo)志物至關(guān)重要。隨著高通量測(cè)序技術(shù)準(zhǔn)確性的不斷提高，曾經(jīng)作為轉(zhuǎn)錄“暗物質(zhì)”的 lncRNAs 在生物領(lǐng)域的重要性越來(lái)越受到科研工作者的重視。大量致力于 lncRNAs 如何參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展的研究已成為熱點(diǎn)。lncRNAs 可在多個(gè)水平參與基因表達(dá)的調(diào)控：作為信號(hào)，lncRNAs 可與蛋白質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合，誘導(dǎo)該生物復(fù)合物與下游基因的啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)控轉(zhuǎn)錄，影響基因表達(dá)； lncRNAs 可作為引導(dǎo)員，引導(dǎo)蛋白移動(dòng)到靶向基因啟動(dòng)子位點(diǎn)；作為誘餌，依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，調(diào)控 RNA 之間的相互結(jié)合；或作為骨架來(lái)招募蛋白復(fù)合物[9]。因此，識(shí)別 PDAC 相關(guān)的 lncRNAs 能夠?yàn)檫M(jìn)一步明晰 PDAC 發(fā)生發(fā)展以及判斷預(yù)后提供更有價(jià)值的理論基礎(chǔ)。

AB

Figure 2 Kaplan-Meier survival analysis for DFS (A) and OS (B) of lncRNA CCHE1expression in PDAC patients

表 3 胰腺導(dǎo)管腺癌患者預(yù)后因素多元分析

lncRNA CCHE1 參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，首先由 Yang 等[10]在卵巢癌中發(fā)現(xiàn)。Chen 等[11]的研究提示lncRNA CCHE1 與卵巢癌不良預(yù)后相關(guān)。其后有研究提示，lncRNA CCHE1 可通過ERK/MAPK 信號(hào)通路參與肝癌和非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展[12]；并且在腸癌中和 ERK/COX-2 通路的激活正相關(guān)[13]；lncRNA CCHE1 在口腔鱗狀細(xì)胞癌中通過競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源 RNA 機(jī)制與 miR-922 結(jié)合，調(diào)控 PAK2 的表達(dá)從而加速其發(fā)生發(fā)展[14]；另外，Jin 等[15]的研究提示，lncRNA CCHE1 能調(diào)控 ROCK1 的表達(dá)，從而促進(jìn) PDAC 的侵襲轉(zhuǎn)移。但 lncRNA CCHE1 在 PDAC 中的臨床意義未見報(bào)道。

本研究通過 PDAC 的細(xì)胞和組織樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)同胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞和正常癌旁組織相比，lncRNA CCHE1 在癌細(xì)胞和組織中均呈過表達(dá)。回顧臨床病理資料，lncRNA CCHE1 的表達(dá)同腫瘤分化程度和 TNM 分期密切相關(guān)。單因素和多因素生存分析顯示，lncRNA CCHE1 是 PDAC 不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，同患者的 DFS 以及 OS 均密切相關(guān)，雖然其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義尚不能撼動(dòng) TNM 分期的臨床預(yù)測(cè)效能，但在未來(lái)的研究中如果能夠發(fā)現(xiàn)更多的同 PDCA 預(yù)后相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分子，綜合分析并建立多分子的聯(lián)合預(yù)測(cè)模型，可能為 PDCA 的預(yù)后評(píng)效提供有意義的參考。本研究的結(jié)果證實(shí) lncRNA CCHE1 可作為判斷 PDAC 患者生存及預(yù)后的分子標(biāo)志物，進(jìn)一步闡釋 lncRNA CCHE1 的功能和臨床意義，有助于 PDAC 患者的治療。但由于本研究納入的為單中心數(shù)據(jù)，研究結(jié)論有待大宗數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步補(bǔ)充和完善。另一方面，關(guān)于 lncRNA CCHE1 表達(dá)變化同 PDAC 惡性表型的關(guān)系及其具體調(diào)控機(jī)制仍需我們通過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)結(jié)論進(jìn)行進(jìn)一步闡述。

[1] Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2019. CA Cancer J Clin, 2019, 69(1):7-34.

[2] Maitra A, Fukushima N, Takaori K, et al. Precursors to invasive pancreatic cancer. Adv Anat Pathol, 2005, 12(2):81-91.

[3] Okusaka T, Furuse J. Recent advances in chemotherapy for pancreatic cancer: evidence from Japan and recommendations in guidelines.J Gastroenterol, 2020, 55(4):369-382.

[4] Pu N, Yin L, Habib JR, et al. Optimized modification of the eighth edition of AJCC TNM staging system for resected pancreatic ductal adenocarcinoma. Future Oncol, 2019, 15(30):3457-3465.

[5] Muers M. RNA: genome-wide views of long non-coding RNAs. Nat Rev Genet, 2011, 12(11):742.

[6] Chen L, Zhang J, Chen Q, et al. Long noncoding RNA SOX2OT promotes the proliferation of pancreatic cancer by binding to FUS. Int J Cancer, 2020, 147(1):175-188.

[7] Li H, Wang X, Wen C, et al. Long noncoding RNA NORAD, a novel competing endogenous RNA, enhances the hypoxia-induced epithelial-mesenchymal transition to promote metastasis in pancreatic cancer. Mol Cancer, 2017, 16(1):169.

[8] Egawa S, Toma H, Ohigashi H, et al. Japan Pancreatic Cancer Registry; 30th year anniversary: Japan Pancreas Society. Pancreas, 2012, 41(7):985-992.

[9] Mattick JS, Rinn JL. Discovery and annotation of long noncoding RNAs. Nat Struct Mol Biol, 2015, 22(1):5-7.

[10] Yang M, Zhai X, Xia B, et al. Long noncoding RNA CCHE1 promotes cervical cancer cell proliferation via upregulating PCNA. Tumour Biol, 2015, 36(10):7615-7622.

[11] Chen Y, Wang CX, Sun XX, et al. Long non-coding RNA CCHE1 overexpression predicts a poor prognosis for cervical cancer. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2017, 21(3):479-483.

[12] Liao Y, Cheng S, Xiang J, et al. lncRNA CCHE1 increased proliferation, metastasis and invasion of non-small lung cancer cells and predicted poor survival in non-small lung cancer patients. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2018, 22(6):1686-1692.

[13] Gaballah HH, Gaber RA, Elrashidy MA, et al. Expression of long non-coding RNA CCHE1 in colorectal carcinoma: correlations with clinicopathological features and ERK/COX-2 pathway. Mol Biol Rep, 2019, 46(1):657-667.

[14] Wang Y, Tong J, Lin H, et al. CCHE1 accelerated the initiation of oral squamous cell carcinoma through enhancing PAK2 expression by sponging miR-922. J Oral Pathol Med, 2020, 49(7):636-644.

[15] Jin X, Ye L, Lin M, et al. lncRNA-CCHE1 is involved in migration and invasion but not in proliferation of pancreatic adenocarcinoma cells possibly by interacting with ROCK1. Oncol Lett, 2019, 18(2):1218-1224.

Clinical significance of long non-coding RNA CCHE1 in pancreatic ductal adenocarcinoma

SHAO Qing-liang, ZANG Hui, GUO En-ling, ZHANG Zhi-qiang

Department of General Surgery, The People's Hospital of Liaoning Province, Shenyang 110016, China

To investigate the expression level of long non-coding RNA cervical carcinoma high-expressed 1 (lncRNA CCHE1) in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) cell and tissue and evaluate its prognostic value in PDAC.PDAC tissue as well as adjacent normal tissue and PDAC cells and pancreatic ductal epithelial cells from patients diagnosed with PDAC and PDAC cells were harvested in this study. Expression of lncRNA CCHE1 was measured by real-time PCR. ANOVA analysis was performed to evaluate the association between lncRNA CCHE1 and clinical manifestation of PDAC patients. K-M survival analysis was utilized to determine correlation of PDAC expression with 5-year survival. Cox's proportional hazards regression models were applied to analyze the relationships between lncRNA CCHE1 and prognosis of PDAC patients.lncRNA CCHE1 was up-regulated in PDAC cells and tissues. Expression of lncRNA CCHE1 was closely associated with tumor differentiation and TNM stage of PDAC (< 0.05). Expression of lncRNA CCHE1 was negatively correlated with disease free survival and overall survival.Expression of lncRNA CCHE1 is negatively associated with survival outcome of PDAC. lncRNA CCHE1 is an independent prognostic risk factor of PDAC.

lncRNA CCHE1; pancreatic ductal adenocarcinoma; prognosis; survival

SHAO Qing-liang, Email: sky7711@sina.com

遼寧省自然科學(xué)基金（20170540566）

邵慶亮，Email：sky7711@sina.com

2020-08-28

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.01.003