siRNA和microRNA用于抗病毒的研究進展

孫博，林嘉杰，王樹松，孫紹光

·綜述·

siRNA和microRNA用于抗病毒的研究進展

孫博，林嘉杰，王樹松，孫紹光

050017 石家莊，河北醫科大學研究生學院（孫博、林嘉杰、王樹松、孫紹光）；050051 石家莊，河北省計劃生育科學技術研究院（孫博、王樹松）

1999 年，Hamilton 和 Baulcombe[1]首次提出了小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）的概念，發現植物中自然發生的 siRNA 能引起轉錄后的基因沉默現象。2001 年，Elbashir 等[2]發現合成的 siRNA 能夠引起不同哺乳動物細胞系的基因沉默現象。這一發現表明，通過合成 siRNA 能夠引發可控的基因沉默現象，甚至有可能作為基因特異性治療劑。近年來，通過 siRNA 來沉默病毒復制關鍵基因的表達，已成為抗病毒感染研究的熱點。1993 年，Lee 等[3]在秀麗隱桿線蟲中首次發現了微 RNA（microRNA，miRNA）。該線蟲中 lin-4 基因的兩種小轉錄物（分別為 22 和 61 nt）能與 lin-14 mRNA 的 3'-UTR 發生堿基互補配對，從而抑制 lin-14 mRNA 的翻譯。2000 年，Pasquinelli 等[4]發現了第二種 miRNA——let-7，同時發現 let-7 在不同物種中高度保守。這促使大量研究人員投入到 miRNA 的研究中。隨著研究的不斷深入，發現 miRNA 水平的紊亂與多種疾病的發生有關[5-6]。需要特別指出的是，miRNA 在病毒感染過程中發揮重要作用。有研究表明，miRNA 既能抑制病毒在宿主細胞內的復制，也能促進病毒在宿主細胞內的復制[7-8]。這說明 miRNA 模擬物和 miRNA 拮抗劑有望成為抗病毒藥物的研發熱點。因此，探究參與病毒感染過程中的 siRNA 和 miRNA，對病毒感染的治療具有重大意義。

1 siRNA 和 miRNA 的生成

siRNA 是一種長度為 21 ~ 23 bp 的小片段雙鏈 RNA（double stranded RNA，dsRNA），主要引起 RNAi 現象。siRNA 誘導 RNAi 的基本過程如下[9-11]：首先，外源性 dsRNA 通過 Dicer 酶和 TAR-RNA 結合蛋白（TAR-RNA binding protein，TRBP）的剪切，形成 21 ~ 23 bp 的 siRNA。然后，siRNA 與 AGO 復合體結合形成 RNA 誘導的沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC）。最后，siRNA 被解鏈成單鏈 RNA，通過與靶 mRNA 匹配來進一步發揮作用。

miRNA 是由內源性基因轉錄生成的長度約為 22 nt 的單鏈 RNA 分子，對靶 mRNA 的轉錄后水平降解和翻譯水平抑制能夠引起 RNAi 現象。miRNA 的經典生成途徑如下[10, 12-16]：首先，在 RNA 聚合酶 II（RNA pol II）的作用下，編碼 miRNA 的內源性基因在細胞核中轉錄生成初級 miRNA（primary miRNA，pri-miRNA）。然后，pri-miRNA 經微處理器的作用下剪切 3' 端和 5' 端的核苷酸序列生成前體 miRNA（precursor miRNA，pre-miRNA），其中微處理器是由 Drosha 酶、DGCR8 蛋白以及其他幾種輔助因子構成。pre-miRNA 經 Exportin 5 復合物轉運出核后，在細胞質中經過 Dicer 酶和 TRBP 進一步剪切生成不完全互補配對的 miRNA 雙鏈。最后，miRNA 雙鏈與 AGO 復合體結合形成 RISC，miRNA 雙鏈繼而解鏈成單鏈 miRNA，保留在 RISC 中的即為成熟的單鏈 miRNA。除上述 miRNA 的經典生成途徑外，miRNA 還有兩種非經典生成途徑：一是不依賴微處理器的 miRNA 生成途徑[17]，二是不依賴 Dicer 酶的 miRNA 生成途徑[18]。

2 抗病毒研究進展

2.1 siRNA 抗病毒研究

2.1.1 人乳頭瘤病毒 與大多數病毒不同，人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）在感染細胞后不會在同一細胞內產生子代病毒。相反，HPV 會在宿主細胞分裂出的子代細胞內進行病毒復制[19]。HPV 基因組表達的 E6/E7 癌蛋白會影響宿主細胞的細胞周期，在抑制宿主細胞分化狀態的同時會使細胞無限增殖[20]。已有研究表明，與對照組相比，實驗組中轉染 HPV E7 siRNA 的 HeLa 細胞存活率明顯升高，細胞中HPV 的復制顯著受到抑制[21]。在體內實驗中，通過多離子復合物膠囊靶向遞送 HPV E6/E7 siRNA 進入腫瘤小鼠體內，結果顯示小鼠體內 HPV 復制減少，腫瘤生長受到抑制[22]。因此，靶向 HPV E6/E7 mRNA 的siRNA 可通過發揮抗 HPV 的作用，來治療由 HPV 感染引起的宮頸癌等疾病。

2.1.2 呼腸孤病毒 呼腸孤病毒（reoviruses，REO）基因組包含大約 10 個 dsRNA 片段。Kobayashi 等[23]用質粒載體構建了穩定表達 siRNA 的 293T 細胞系，穩定表達的 siRNA 特異性靶向 REO T3D 株的非結構蛋白 sigmaNS 和 muNS 以及核心蛋白 mu2 的 mRNA。在該 293T 細胞系中，REO T3D 株復制被顯著抑制，并且該抑制作用具有特異性，只對 REO T3D 株具有抑制作用。另外，在昆蟲體內也發現 siRNA抑制 REO 復制的現象[24]。因此，siRNA 是潛在的抗 REO 藥物。

2.1.3 冠狀病毒 多項研究表明，特異性 siRNA 具有抗嚴重急性呼吸系統綜合征冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）感染的作用。Wu 等[25]設計了 7 個靶向 SARS-CoV 病毒序列的 siRNA，結果表明靶向刺突蛋白 S 和 3'-UTR 的 siRNA 能夠抑制 SARS-CoV 在 Verno-E6 細胞中的復制。Shi 等[26]通過靶向 SARS-CoV 的包膜蛋白（envelope protein，E 蛋白）、核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，N 蛋白）和膜蛋白（membrane protein，M 蛋白）mRNA 設計了 26 個 siRNA，結果表明 3 個siRNA 對病毒的抑制率能夠超過 70%，11 個 siRNA 的抑制率在 40% ~ 70% 之間，并且發現聯合使用靶向病毒 mRNA 不同區域的 siRNA 會提高病毒抑制率。在動物模型研究方面，Tang 等[27]在恒河猴模型上證明了 siRNA 抗 SARS-CoV 病毒的有效性，并且 siRNA 劑量在 10 ~40 mg/kg 時，沒有表現出毒性作用。因此，根據 SARS-CoV 基因組設計出的 siRNA，在細胞和動物模型水平顯示出有效的抗 SARS-CoV 活性。需要特別指出的是，針對今年在全球肆虐的嚴重急性呼吸系統綜合征 2 型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2），Alnylam 制藥公司已經在開發靶向 SARS-CoV-2 中的關鍵蛋白mRNA 的 siRNA，用來治療 SARS-CoV-2 感染導致的新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）。siRNA 療法能給 COVID-19 提供新的治療思路。

2.1.4 呼吸道合胞病毒 呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）基因組中最保守的區域之一是生成核蛋白（nucleoprotein，N）、磷蛋白（phosphoprotein，P）和大蛋白（large protein，L）mRNA 的基因[28]。有研究表明，靶向 N 蛋白 mRNA 的 siRNA（即 ALN-RSV01）具有很高的抗病毒活性，體外實驗用人肺上皮細胞檢測 ALN-RSV01 的體外抑制活性，其抑制率高達 97%[29]。用 BALB/c 小鼠作為實驗對象，進一步檢測 ALN-RSV01 在小鼠體內的抑制活性發現，ALN-RSN01 仍可有效降低小鼠體內的病毒滴度[29]。因此，靶向 N、P 和 L mRNA 的 siRNA 是潛在的抗 RSV 藥物。

2.1.5 人類免疫缺陷病毒 研究人員發現，人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的反式轉錄激活因子（transactivator of transcription，Tat）或負調控因子（negative factor，Nef）mRNA 是設計 siRNA 的潛在靶點。研究人員將以 Tat 和 Nef 為靶點設計的特異性 siRNA 轉染 HIV 感染的人胚腎細胞（HEK293），發現 siRNA 顯著抑制 HIV 復制，降低細胞內的病毒含量[30]。為了達到更好的抗病毒效果，研究人員開發出了更好靶向遞送 siRNA 的適配體-siRNA 偶聯物，得到更有效的抗 HIV 治療效果[31]。

綜上所述，siRNA 對多種核酸類型的病毒都具有顯著的抗病毒活性（表 1）。siRNA 具有高度特異性，是潛在的新型抗病毒藥物。因此，siRNA 藥物的開發成為 RNAi 療法的關鍵，是迄今為止對現有抗病毒療法最有力的顛覆。

表 1 siRNA 抗病毒靶點

2.2 miRNA 抗病毒研究

2.2.1 人乳頭瘤病毒 miRNA 與宿主細胞抗 HPV 感染密切相關。Wu 和 Chen[32]研究發現，miR-375 能夠升高 p53 和 p21 的表達水平，降低 Cyclin D1 和 IGF-1R 的表達水平，從而抑制 HPV-18 陽性的宮頸癌細胞增殖；還能夠增強 caspase-3 和 caspase-9 的活性，升高 Bax 的表達水平，降低Bcl-2 和survivin 的表達水平，從而促進 HPV-18 陽性的宮頸癌細胞凋亡。Fujii 等[8]研究發現，miR-331-3p 對神經纖毛蛋白 2（neuropilin 2，NPR2）的靶向作用使得 E6/E7 mRNA 的表達水平降低，從而抑制 HPV 復制和宮頸癌細胞增殖。Gao 等[33]研究發現，在 HPV 感染的人表皮角化細胞中，miR-34a-5p 通過靶向 JAG1/Notch1通路，從而抑制細胞增殖、遷移和侵襲。Zamani 等[34]研究發現，miR-29a 和 miR-21 分別在 HPV 感染所致的宮頸癌細胞中顯著下調和上調，是潛在的宮頸癌抑癌因子和致癌因子。因此，研究 miRNA 在 HPV 感染中的調控作用，將有助于研發抗 HPV 感染的 miRNA 藥物。

2.2.2 輪狀病毒 miRNA 在輪狀病毒（rotavirus，RV）感染與宿主細胞抗RV 感染過程中發揮重要作用。Zhou 等[7]研究發現，在病毒感染的早期，RV 的 NSP4 基因會編碼一種 miRNA——RV-vsRNA1755。該 miRNA 對宿主細胞 IGF1R 的靶向作用導致后者表達水平降低，并通過 PI3K/Akt/mTOR 通路觸發細胞自噬，而 RV 進一步利用細胞自噬，促進自身復制。Mukhopadhyay 等[35]研究發現，RV 感染導致 let-7 表達下調和 miR-99b 表達上調，let-7g 的下調通過調控 TSC1/2 和 Rheb-GTP 間接抑制 mTOR 的表達水平，而 miR-99b 的上調直接抑制 mTOR 的表達水平，兩種 miRNA 協同作用促進細胞自噬，從而促進 RV 復制。Chanda 等[36]研究發現，RV 編碼的非結構蛋白5（nonstructural protein 5，NSP5）能夠上調 miR-142-5p 的表達水平，后者通過調控轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號通路，從而促進 RV復制。Tian 等[37]研究發現，miR-525-3p 在 RV 感染時顯著下調，其能通過靶向 RV 非結構蛋白 1（nonstructural protein 1，NSP1）的 3'-UTR，從而抑制 RV 復制。因此，根據 miRNA 在 RV 復制過程中的促進或抑制作用，研發相應的 miRNA 拮抗劑和模擬物，將成為潛抗 RV 感染的新突破口。

2.2.3 登革熱病毒 miRNA 在抗登革熱病毒（Dengue virus，DENV）感染方面具有重要作用。宿主細胞 miRNA 可直接靶向登革熱病毒RNA 發揮抗病毒作用[38-39]。Wen等[38]發現了第一個靶向 DENV 的宿主細胞miRNA—— miR-548g-3p，其可直接靶向 DENV 5'-UTR 的病毒復制的關鍵元件——SLA 啟動子序列，從而抑制病毒復制。隨后，Castrillon-Betancur 和Urcuqui-Inchima[39]研究發現，DENV 可誘導宿主細胞中 miR-484 和 miR-744 表達水平的下調；而 miR-484 和 miR-744 能夠靶向 DENV 3'-UTR，過表達這兩種 miRNA 能夠抑制 DENV 復制。另外，miRNA 還可以通過增強宿主細胞對 DENV 感染的應答（如免疫應答或防御機制），從而抑制 DENV 復制[40-41]。Escalera-Cueto 等[40]研究發現，let-7c 在感染 DENV 的人肝癌細胞（Huh-7 細胞）中顯著上調，并通過抑制靶基因 BACH1 的表達水平，間接上調抗炎抗氧化蛋白 HO-1 的表達水平，從而抑制受感染細胞中的 DENV 復制，參與宿主細胞的抗病毒先天免疫應答。Zhu 等[41]研究發現，miR-30e* 在感染DENV的HeLa 細胞中顯著上調，并通過 IκBα/IFN-β 抑制 DENV 復制，參與宿主細胞的抗病毒先天免疫應答。因此，研究 DENV 感染期間的 miRNA 表達水平變化，將為 DENV 的治療提供新視角。

2.2.4 甲型流感病毒 miRNA在宿主細胞抗甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）感染和傳統中草藥防治 IAV 中發揮重要作用。Song 等[42]首先發現了 miRNA 能夠抑制IAV復制。犬腎細胞（MDCK 細胞）中的 3 個 miRNA（miR-323、miR-491 和 miR-654）通過靶向 H1N1 IAV 來源的堿性聚合酶 1（polymerase basic protein 1，PB1）的 3'-UTR，導致 PB1 的表達水平降低，從而抑制 H1N1 IAV 復制。Zhang 等[43]研究發現，在 H5N1 IAV 感染的A549 細胞中，宿主細胞 miR-203 的表達水平上調，并通過靶向抑制轉錄下調因子 1（down-regulator of transcription 1，DR1）的表達水平，從而抑制 H5N1 IAV 復制，發揮抗病毒感染作用。Cui 等[44]研究發現，miR-188-3p 具有廣譜抗 IAV 活性。A549 細胞中的 miR-188-3p 直接靶向抑制IAV 編碼的堿性聚合酶 2（polymerase basic protein 2，PB2）的蛋白表達水平，從而有效抑制 IAV（H1N1、H5N6 和 H7N9）復制。有趣的是，Zhou 等[45]研究發現，傳統中草藥金銀花中的一種非典型 miRNA——MIR2911，能夠靶向抑制 H1N1 IAV 編碼的 PB2 和非結構蛋白 1（nonstructural protein 1，NS1）的表達水平，從而抑制 H1N1 IAV 復制；還能夠在體內外抑制 H5N1 IAV 和 H7N9 IAV 復制。即，MIR2911 和含 MIR2911 的金銀花煎煮液具有廣譜的抗 IAV 活性，可用于抑制致命的 IAV 感染。因此，宿主細胞和中草藥中的 miRNA 是抗 IAV 感染的潛在因子。

2.2.5 人類免疫缺陷病毒 miRNA 是潛在的抗人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染的新興分子。Bochnakian 等[46]研究發現，抗病毒因子干擾素（interferon，IFN）能夠上調 miR-128 的表達水平，后者通過靶向轉運蛋白 3（transportin 3，TNPO3）mRNA 的 CDS 和 3'-UTR，顯著下調 TNPO3 的 mRNA 和蛋白表達水平，從而抑制宿主細胞中的 HIV-1 復制。Ortega 等[47]研究發現，在 HIV-1 感染的外周血單核細胞中，白細胞介素-21（interleukin 21，IL-21）誘導的 miR-29 上調能夠抑制病毒復制，限制早期 HIV-1 感染程度。因此，發現抗 HIV 感染的 miRNA 分子，將為 HIV 治療帶來新的希望。

2.2.6 EB 病毒 miRNA 在 EB 病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染中發揮作用。Hooykaas 等[48]研究發現，EB 病毒編碼的 miR-BART16 通過靶向 type I IFN 信號通路中的 CREB 結合蛋白（CREB-binding protein，CBP）的 3'-UTR 并下調后者的表達水平，抑制抗病毒因子 IFN 的生成，從而促進 EBV 感染和復制。因此，miR-BART16 拮抗劑是潛在的抗 EBV 藥物。

2.2.7 白斑綜合征病毒 miRNA 在白斑綜合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）感染中發揮作用。Huang 等[49]研究發現，在感染白斑綜合征病毒的南美白對蝦的胃中檢測到宿主 miR-10a 的表達水平顯著上調，后者能夠靶向 WSSV 病毒基因（vp26、vp28 和 wssv102）的 5'-UTR，上調這三種病毒基因的表達水平，從而促進病毒相關蛋白的翻譯和 WSSV 復制。因此，miR-10a 拮抗劑是潛在的抗 WSSV 感染藥物。

2.2.8 丙型肝炎病毒 miRNA 在丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染中發揮作用。Nieder-R?hrmann 等[50]研究發現，肝臟特異性 miR-122 能夠靶向丙型肝炎病毒RNA 的 5'-UTR 中的兩個保守位點（S1 和 S2），從而增強 HCV RNA 的翻譯和穩定性，促進病毒復制。因此，miR-122 拮抗劑是潛在的抗 HCV 感染藥物。Miravirsen是 Santaris 制藥公司研發的抗 HCV 的 miR-122 拮抗劑，用于治療丙型肝炎，目前該藥正在進行 II 期臨床試驗。臨床前試驗結果表明，miravirsen 能夠顯著降低病毒滴度（> 300 倍），并且在停藥后也沒有觀察到病毒滴度反彈的跡象[51]。

綜上所述，miRNA 同樣對多種核酸類型的病毒都具有顯著的抗病毒活性（表 2）。miRNA 既能抑制病毒復制，也能促進病毒復制。因此，基于 miRNA 的 RNAi 療法分為兩種：miRNA 模擬物和 miRNA 拮抗劑，前者模擬抗病毒 miRNA 發揮病毒抑制作用，而后者拮抗促病毒 miRNA 發揮病毒抑制作用。根據miRNA 在體內病毒感染過程中的作用，研制相應的 miRNA 模擬物或拮抗劑，將為抗病毒治療藥物研發帶來新的希望。

3 siRNA 和 miRNA 藥物的挑戰與策略

3.1 藥物遞送問題

目前，基于 siRNA 和 miRNA 的 RNAi 療法顯現出了潛力巨大的疾病治愈能力。該療法用于抗病毒治療的主要障礙是，如何將藥物精確地遞送到感染部位和炎癥組織而不影響周圍其他組織的正常功能，以及保證藥物到達靶組織后具有很好的生物利用度。siRNA、miRNA 模擬物和 miRNA 拮抗劑都是寡核苷酸片段，具有相似的物理性質，如帶有大量負電荷，很難直接通過被動擴散進入細胞內；具有較大的分子量；穩定性差，裸露的 RNA 分子易被血清的核糖核酸酶降解；半壽期短，容易被腎臟清除[52]。這些不利的物理性質限制了 RNAi 療法的應用，需要不斷發現合適的策略來解決這些問題。

表 2 miRNA 對病毒的作用及靶點

化學修飾可以增強 RNA 分子的穩定性，常用的化學修飾方法有核糖 2'-OH 修飾、鎖核酸修飾和硫代硫酸酯骨架修飾等[53-55]。經過化學修飾后，siRNA 和 miRNA 藥物具有更好的穩定性和更高的沉默效率，提高了生物利用度。雖然化學修飾可以增強 siRNA 和 miRNA 藥物對核糖核酸酶的抵抗力，但不能解決這些帶有大量負電荷的 RNA 分子的跨膜運輸問題。因此，研究人員試圖找出合適的載體，促進 RNAi 藥物的跨膜運輸。

脂質納米顆粒（lipid nanoparticles，LNPs）是目前臨床批準的最先進的非病毒類載體，具有相容性高、可生物降解和攜帶大量 siRNA 或 miRNA 藥物等優點[56]。這些基于可電離脂質的 LNPs 最初發現于肝臟中，目前在 RNAi 療法中前景廣闊。已獲得 FDA 和 EMA 批準的 patisiran 就是基于 LNPs 的 siRNA 藥物。因此，LNPs 也被認為是最重要非病毒類載體之一，各種修飾的 LNPs 為靶向遞送 siRNA 和 miRNA 開辟了新途徑[57]。

N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalactosamine，GalNAc）是去唾液酸糖蛋白受體（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）的一種高親和力配體；而 ASGPR 是一種主要表達在肝細胞表面的 C 型凝集素，能通過受體介導內吞作用。因此，利用 GalNAc 和 ASGPR 特異性結合可以實現特異性靶向肝臟給藥[58]。將 siRNA 或miRNA 與 GalNAc 偶聯，形成共軛三聚體，能將 RNAi 藥物靶向遞送至肝細胞，從而引起肝細胞內的基因沉默[59]。Alnylam 與諾華公司聯合開發的 Inclisiran 是一種靶向前蛋白轉化酶枯草溶菌素 9（proprotein convertase subtilisin-kexin type 9，PCSK9）mRNA 的長效 siRNA，通過與 GalNAc 偶聯，被肝細胞特異性攝取，從而治療高膽固醇血癥。在臨床試驗中，Inclisiran 能有效降低 50% 以上的 LDL-C 水平，一年僅需注射兩次，并且安全性很高[60]。Regulus Treeutics 公司開發的 RG-101 是 miR-122 拮抗劑-GalNAc 偶聯物，II 期臨床試驗表明，RG-101 能使慢性丙肝患者體內的病毒水平顯著下降[61]。GalNAc 共軛技術代表一類新的發展中的 RNA 遞送方式，Dicerna 公司開發出了四聚體 GalNAc 聚合物——GalXC，四聚體 GalXC 與 ASGPR 的親和力更高。基于 GalXC，Dicerna 公司已經研制了數種正在臨床試驗的藥物和十幾種正在早期研發的藥物。

Arrowhead 制藥公司開發的靶向 RNAi 分子（TRIM）平臺，能夠篩選有效的 siRNA、高親和力的靶向配體和連接子，從而產生特異性的 siRNA 遞送平臺。基于該平臺，Arrowhead 開發出了 ARO-ANG3 用于治療高甘油三酯血癥[62]。SlienSeed 研發了一種可生物降解的微型基質——LODER（LOcal Drug EluteR），可以緩慢持久地向局部釋放其所封裝的藥物。siG12D-LODER 是基于 LODER 技術開發出的聚合物系統復合物，通過內窺鏡超聲活檢程序放入胰腺腫瘤內，克服了 siRNA 遞送障礙。siG12D-LODER 能夠向靶點緩釋靶向 KRAS 的 siRNA，抑制 KRAS mRNA 和蛋白質表達水平，從而有效抑制癌細胞生長[63]。

3.2 脫靶效應和免疫毒性

脫靶效應（off-target）是指 siRNA 通過 RNAi 機制作用于非靶 mRNA，從而導致非靶 mRNA 的基因沉默現象。siRNA 與靶 mRNA 通過完全互補配對結合，具有高度特異性，但是合成的 siRNA 在哺乳動物體內會產生脫靶效應。siRNA 能夠產生兩種類型的脫靶效應，一類是 siRNA 發揮 miRNA 功能，通過“種子序列”互補配對使許多非靶 mRNA 表達水平降低，此類型脫靶效應會引起細胞毒性[64]。另一類是 siRNA 正義鏈和反義鏈競爭與 AGO 復合體結合形成 RISC，正義鏈結合形成的RISC 會引起非靶 mRNA 沉默[65]。化學修飾能夠降低 siRNA 的脫靶效應，2'-脫氧-2'-氟和 2'-甲氧基戊呋喃糖化學修飾，不僅可以提高 siRNA 穩定性，還可以降低脫靶效應[66]。另外，siRNA、miRNA 模擬物和 miRNA 拮抗劑進入體內后，可能會通過Toll 樣受體信號通路非特異性激活免疫系統來誘發免疫反應[67-68]。化學修飾也可以有效消除非特異性免疫反應[69]。

3.3 疾病異質性

病毒容易發生突變，所以一種 siRNA 或 miRNA 對某種 mRNA 的單一靶向，不能夠有效抑制病毒復制。因此，多種 siRNA 或 miRNA 聯合靶向病毒的多種 mRNA 能夠形成協同的沉默效應，從而更有效發揮抗病毒作用[70]。此外，將 siRNA 或 miRNA 藥物與目前 FDA 批準的抗病毒藥物聯合使用，可能有利于病毒感染的治療，并可能成為新的抗病毒治療方式。

3.4 長期應用安全性

自從 1998 年 RNAi 機制發現以來，研究 RNAi 才不過二十二年，因此對 RNAi 療法的研究存在著不足。第一個 RNAi 藥物上市才不到兩年，沒有長期和大量的患者數據來證明 RNAi 療法是絕對安全的，需要進一步的研究和觀察[71]。另外，載體的安全性也需要進一步研究。使用 LNPs 載體在給藥后會誘發炎癥反應和免疫細胞活化[72]。

4 總結及展望

siRNA 和 miRNA 通過靶向病毒感染過程中的關鍵基因，調控各種類型的病毒增殖。因此，基于 siRNA和 miRNA 的抗病毒藥物具有巨大的治療潛力。但目前，基于 siRNA 和 miRNA 的抗病毒藥物僅處于臨床試驗階段。要解決的問題是，如何把設計好的 siRNA、miRNA 模擬物和 miRNA 拮抗劑安全有效地運送到靶組織，不斷發展的化學修飾技術和給藥載體很好地解決了這個問題，但都存在一定的局限性。未來該技術發展的關鍵是研發出一種安全、無毒、高效的給藥系統。另外，從飲食中獲取植物 miRNA 的抗病毒途徑不需要額外的化學修飾和給藥載體，將成為 miRNA 抗病毒藥物研發的新途徑。

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王樹松，Email：wshsong@sina.com；孫紹光，Email：sunshaoguang00@163.com

2020-07-20

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.01.009