基于生物信息學的補氣活血通絡方對特發性肺間質纖維化的作用機制研究

于小林 張曉梅 張艷霞

特發性肺間質纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)臨床上一類病因尚不清楚的呈進展性、彌漫性的間質性肺病[1]，患者的中位生存期僅2～4年，發病率為每年3～9/10萬[2]。目前，臨床上缺乏有效的治療手段。網絡藥理學是挖掘與預測藥物靶標的重要方法，在探索中藥復方的起效成分與作用靶點方面具有較為廣泛的應用。既往的網絡藥理學研究中對于疾病靶點的確定存在一定的局限性，疾病靶點與臨床實際的關聯較為欠缺。基于臨床大樣本基因芯片數據，通過生物信息學手段，結合實際的臨床性狀與隨訪信息，對于中藥復方的抗纖維化靶點與潛在分子機制進行探索，為進一步的研究提供思路與線索。課題組前期研究已經證實，補氣活血通絡方具有明確的抗纖維化作用[3]，本次研究基于改進的網絡藥理學方法，對具體其作用靶點進一步挖掘。

1 材料與方法

1.1 補氣活血通絡方成分獲取及靶點預測

補氣活血通絡方的藥物組成為黃芪、金銀花、當歸、甘草、穿山龍、石韋、浙貝母、瓜蔞、桔梗、枳殼、紅景天，通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(http://tcmspw.com/tcmsp.php)獲取復方中所有中藥的成分，按照類藥性(drug likeness,DL)≥30% 以及口服利用度(oral bioavailability,OB)≥0.18作為標準，篩選出具有潛在藥物活性的成分，并獲取其相應的靶點，同時刪去沒有靶點記錄的成分。

1.2 基因芯片數據準備

本次研究的基因表達譜數據集來自于Gene Expression Omnibus (GEO)數據庫，需要滿足以下納入標準：(1)樣本來源于診斷為IPF的臨床病例；(2)樣本類型為肺組織活檢；(3)數據類型為基因芯片得出的轉錄組數據；(4)單個數據集的樣本量大于100例。下載符合納入標準的數據集的表達矩陣，將矩陣合并后進行批次校正，減小系統誤差。

1.3 加權基因共表達網絡的構建

加權基因共表達網絡可以從整體層面得出相似表達模式的基因模塊并與臨床表型相關聯[4]，可以更宏觀地認識基因的潛在功能。以基因芯片獲取的基因表達矩陣為基礎，以WGCNA包構建加權基因共表達網絡，通過計算各個基因表達量之間的相互關系，將整體基因表達譜歸為若干個基因模塊，每個模塊內部的基因具有相似的表達模式，進而計算每個模塊與臨床信息的皮爾森相關系數，從高相關性的模塊中選取相對于某一臨床性狀的關鍵基因，并將此關鍵基因與補氣活血通絡方的靶基因取交集，得出中藥復方調控肺間質纖維化的潛在靶點。

1.4 生存相關基因的確定與功能注釋

為了進一步判斷所獲得的靶點的臨床意義，本研究結合生存數據，確定每個靶點基因對于患者生存時間的價值。自GEO數據庫下載具有生存時間的IPF數據集GSE27957與GSE28042，以此數據集為基礎，對前文得出的肺纖維化潛在靶點基因做單因素cox回歸分析，篩選出與生存時間相關的靶點基因。對于篩選出的基因，以limma包進行差異分析，篩選出相對于此基因具有顯著表達差異的相關基因，行GO與KEGG富集分析，得出此基因的潛在生物學功能。

1.5 統計學方法

本研究以R語言進行統計學分析，以WGCNA包構建加權共表達網絡[5]，批次校正采用sva包的ComBat函數[6]，單因素cox回歸分析采用survival包[7]，假設檢驗采用Wald檢驗。差異分析采用limma包經驗貝葉斯法[8]，基因功能注釋以clusterProfiler包的GO與KEGG富集分析實現[9]。變量間的相關關系采用皮爾森相關性系數表示,P<0.05認為具有統計學差異。

2 結果

2.1 補氣活血通絡方中活性成分及潛在靶點預測

在TCMSP數據庫中檢索補氣活血通絡方中每一味中藥的成分，對于符合DL≥30%,以及OB≥0.18篩選標準的活性成分，檢索其對應的靶點，刪去無對應靶點的成分，最終得出132種活性成分，所對應的靶點基因共245種。

2.2 構建加權共表達基因網絡

根據納入標準，納入本次研究的數據集為GSE32537[10]與GSE47460[11]，共包含279例IPF樣本與158例對照樣本。將兩個數據集的表達矩陣合并后構建加權共表達網絡，得到相應的基因模塊(圖1)，每個模塊代表一組具有相似表達模式的基因。各個基因模塊以不同的顏色表示，灰色模塊代表基因不能歸入其他模塊。每個方框中第一行數字為相關系數，下方括號中的數字為P值。本研究著重考慮與IPF發病相關的基因，故在圖中“diagnosis”一列，選擇基因模塊與臨床性狀的皮爾森相關系數絕對值大于0.4的模塊(分別為紅色red、紫色purple、藍綠色turquoise、藍色blue、黑色black、洋紅色magenta)，該部分模塊與IPF的診斷相關性較大。

圖1 基因模塊—臨床性狀關系圖

2.3 補氣活血通絡方有效成分對肺間質纖維化作用靶點的確定

提取高相關性基因模塊的關鍵基因共372個，與補氣活血通絡方的靶點基因取交集，共得到13個基因(圖2)，此交集可以看做中藥復方對于肺間質纖維化的靶點，同時繪制中藥復方的靶點調控網絡(圖3)，圖中紅色三角形代表13個基因，藍色矩形代表基因對應的中藥復方單體成分，以TCMSP數據庫中的MOL編號表示。GSE27957[12]與GSE28042[13]共包含120例帶有生存數據的IPF樣本，基于其基因表達矩陣，從這13個基因中可以篩選出兩個生存相關的IPF靶基因(表1)，分別是骨髓細胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1,MCL1)與血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth facter A,VEGFA)，兩個基因的風險比(hazard tatio,HR)均大于1，是肺纖維化發病的危險因素。結合中藥復方靶點信息，構建補氣活血通絡方調控肺間質纖維化生存相關靶點圖(圖4)，可以看出此復方主要起效的成分為β-胡蘿卜素、木犀草素、槲皮素。

表1 篩選出生存相關的IPF靶基因

圖2 診斷相關基因與中藥復方靶點基因交集

圖3 中藥復方成分—肺纖維化靶點調控網絡

圖4 補氣活血通絡方調控肺間質纖維化生存相關靶點圖

2.4 補氣活血通絡方對于肺纖維化生存相關機制的影響

通過對共表達基因進行富集分析，對MCL1與VEGFA進行功能注釋，可以推斷出其參與的生物學機制與信號通路。MCL1的富集結果如表2所示，其生物學功能主要是對于生物活性因子的應答以及細胞因子間的相互作用，信號通路主要富集于EGFR通路；VEGFA的富集結果如表3所示，其生物學功能除了對于血管生成的調控外，也參與了機體的免疫反應，尤其是中性粒細胞參與的免疫應答，參與的信號通路主要為NF-κB通路、PI3K/Akt通路以及EGFR通路。

表2 MCL1功能注釋

表3 VEGFA功能注釋

3 討論

既往的網絡藥理學研究大都從疾病基因數據庫中獲取對于某一疾病的相關基因，進而以蛋白互做網絡預測潛在作用靶點，這種方法獲取的基因可能是來源于基礎實驗或者算法預測，臨床相關性較為欠缺，且容易受到數據庫收錄基因數目與數據庫算法的限制，對于疾病基因的認識可能相對不完善。本研究基于實際臨床大樣本的基因芯片數據，創新性的以加權基因共表達網絡為切入點，融合了兩個獨立的大樣本臨床試驗的結果，獲取了IPF發病中的關鍵基因，具有一定的臨床可信度。進而結合數據庫中收錄的中藥復方成分及靶點信息，確定了中藥復方對于IPF的作用靶點，最后基于源自另一獨立隊列的生存信息，以cox回歸分析為篩選手段，確定了與肺纖維化生存時間相關的靶點。整個分析過程所選取的臨床隊列均相互獨立，分析的結果可以相互驗證，具有一定的臨床指導意義。

中藥復方具有多成分、多靶點的特征，對于中藥活性成分及作用靶點的研究一直是中醫藥基礎研究的重要課題。生物信息學可以極大的提高中醫藥的研究效率，從整體基因組的特征出發，可以有針對性的獲取中藥對于特定表型或性狀的靶點信息。

MCL1是一類廣泛表達于人體各個組織中的抗凋亡蛋白[14]。MCL1通過對細胞凋亡的調節作用，在調控細胞的分化與增殖，影響腫瘤的發生和發展等方面發揮重要的作用[15]。在肺間質纖維化領域，關于MCL1的研究較為欠缺。本研究通過GO與KEGG功能注釋，發現MCL1在肺纖維化過程中主要參與的生物學通路為EGRF信號通路。EGFR在肺癌領域有深入的研究，針對EGFR的靶向用藥具有廣泛的應用。在肺纖維化領域，Epstein SG等[16]發現肺纖維化患者的成纖維細胞中EGFR表達異常，具有顯著的促纖維化作用。本研究也同樣支持EGFR為肺纖維化的危險因素，并且與患者的生存時間密切相關。補氣活血通絡方中的活性成分可能通過調節MCL1的抗凋亡作用，從而抑制成纖維細胞的分化增殖而起到抗纖維化作用。

VEGFA在廣泛參與了肺纖維化的進程，以VEGFA為治療靶點可以顯著改善肺纖維化病情，對此中西醫相關研究均有報道[17-18]。需要注意的是，GO分析中顯示VEGFA不僅參與了血管生成的生物學過程，還對中性粒細胞的免疫反應有調節作用，近期的一項研究也報道，VEGFA可以調控中性粒細胞在炎癥區域的募集與功能[19]。在肺纖維化領域尚無相關報道，關于VEGFA的免疫調節作用尚待進一步實驗研究證實，該富集結果為肺纖維化中的免疫相關研究提供了新的思路與方向。本研究顯示，VEGFA的共表達基因顯著富集于NF-κB通路、PI3K/Akt通路以及EGFR通路，均為肺纖維化研究中的經典通路。補氣活血通絡方以VEGFA為作用靶點的抗纖維化作用，可能是基于調節VEGFA參與的血管生成與免疫應答而實現，主要涉及的通路為NF-κB通路、PI3K/Akt通路以及EGFR通路。

前期研究顯示，補氣活血通絡方可以顯著改善肺組織纖維增殖，改善大鼠肺功能，維持肺泡表面活性物質的正常分泌，具有明確的抗纖維化作用[20]。本次研究以生物信息學為手段，進一步挖掘補氣活血通絡方對于肺間質纖維化治療的潛在靶點，確定了復方中的相關活性成分可以通過靶向MCL1、VEGFA基因而起到抗纖維化作用。前期實驗研究也同樣證實，補氣活血通絡方對PI3K/Akt信號通路有明顯的抑制作用[21]，從免疫組織化學層面也印證了本次數據挖掘結果的準確性。

綜上所述，補氣活血通絡方以MCL1、VEGFA為作用靶點，作用于NF-κB通路、PI3K/Akt通路以及EGFR通路從而起到抗纖維化作用，可與前期實驗研究相互佐證，并推測出此復方中可能起效的關鍵成分。本文是對于傳統網絡藥理學的方法學改進，使其更貼合臨床樣本，但是容易受到所納入基因芯片質量與臨床信息準確性的影響，與傳統網絡藥理學相比各有優缺點。