Gas6對類風濕關節炎小鼠Th17/Treg細胞平衡和炎癥反應的調控作用

盧陽 陳萍 林素仙 姜建昌 王勝男 張智勇 楊美綠

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關節組織慢性炎癥性病變為主要表現的免疫性疾病。機體免疫系統改變，特別是細胞免疫異常，在RA發生過程中所起的關鍵性作用越來越受到重視[1-2]。有研究發現，在RA患者外周調節性T細胞（regulatory T cell，Treg）的比例明顯下降，且存在以分泌IL-17為特征的CD4+T細胞（Th17）細胞增殖，這種Th17/Treg失衡是導致RA炎癥和損傷的重要因素[3-4]。既往研究發現，生長停滯特異性蛋白 6（growth arrest-specific 6，Gas6）能促進Treg功能活化（呈濃度依賴性），增強Treg對T細胞增殖的抑制能力[5-6]。此外，缺失Gas6的小鼠Th17細胞顯著增殖，呈現出Th17/Treg失衡的現象，導致炎癥反應的發生[7]。鑒于Treg在RA發病過程中的關鍵作用，筆者推測Gas6能夠調控RA小鼠Th17/Treg平衡，從而減輕炎癥和關節損傷，為此，筆者通過建立膠原誘導的關節炎（collagen induced arthritis，CIA）小鼠模型，探討 Gas6對Th17/Treg細胞平衡和炎癥反應的調控作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及試劑 雄性SPF級DBA/1J小鼠24只（8周齡，體重22～25 g）購自上海斯萊克實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2012-0002，飼養于溫州醫科大學實驗動物中心。弗氏完全佐劑（F5881）和弗氏不完全佐劑（F5506）購自美國Sigma公司，牛Ⅱ型膠原蛋白購自美國Chondrex公司（20022）。重組小鼠Gas6購自美國R & D公司（CF 8310-GS-050）。IL-10 ELISA試劑盒購自上海欽誠生物科技公司（QC-IL10-Mu），IL-17 ELISA試劑盒購自聯邁生物公（LM-IL-17-Mu）。FITC標記的大鼠抗小鼠CD4抗體（553046）、PE標記大鼠抗小鼠叉頭蛋白翼狀螺旋轉錄因子 P3（Forkhead/winged helix transcription factor p3，Foxp3）抗體（560414）和PE標記大鼠抗小鼠IL-17A抗體均購自美國BD公司（561020）。

1.2 實驗分組及CIA小鼠模型制備 將小鼠按照隨機數字表法分為4組，即對照組、CIA組、CIA+生理鹽水組和CIA+Gas6組，每組6只。參考文獻[8]建立動物模型。實驗遵循國際通行的動物福利和倫理準則。第1天后3組小鼠在尾根部皮下注射0.1 ml由弗氏完全佐劑與牛Ⅱ型膠原蛋白等體積（各0.05 ml）混合乳劑，第21天再次注射0.1 ml弗氏不完全佐劑與牛Ⅱ型膠原蛋白等體積（各0.05 ml）混合乳劑，構建CIA模型。對照組以0.9%氯化鈉注射液替代牛Ⅱ型膠原蛋白。CIA+Gas6組小鼠在第2次注射后立即腹腔注射30 μg/ml的Gas6 0.1 ml，以后每3天1次，共3次，總劑量為9 μg。CIA+生理鹽水組小鼠在第2次注射后，立即腹腔注射0.9%氯化鈉注射液0.1 ml，以后每3天1次，共3次。

1.3 關節炎指數（arthritis index，AI）評分 第1次注射后42 d，對小鼠四肢進行AI評分，共分為5級。0分：正常，關節無紅腫；1分：足趾關節輕度紅腫；2分；足趾關節和足跖腫脹；3分：踝關節以下足爪紅腫；4分：包括踝關節在內的全部足爪均有紅腫且伴有功能障礙。每只小鼠AI評分為四肢關節評分之和，總分最高為16分。

1.4 IL-10和IL-17水平檢測 第1次注射后42 d，小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉0.2 ml麻醉后打開腹腔，采集下腔靜脈血1.0 ml，EDTA抗凝，2500 r/min，離心15min（4℃），取上清液，采用ELSIA試劑盒檢測IL-17和IL-10水平。

1.5 Treg和Th17細胞檢測 采用流式細胞術。下腔靜脈取血完畢后處死小鼠，留取脾臟，置于40 μm孔徑濾網上研磨成勻漿，用PBS重懸細胞，并調節細胞密度至1×107個/ml。等分細胞懸液，每管 50 μl，再加 50 μl流式染色緩沖液。加入抗CD4-FITC，4℃避光孵育1 h，PBS洗2次后，分別染色IL-17A和Foxp3，以檢測Th17和Treg細胞比例。Th17細胞檢測：每個樣本加入2 ml流式染色緩沖液，400 g/min離心5 min，棄上清液，每管加入流式染色緩沖液100 μl重懸細胞，并加入1 μg/ml的IL-17A抗體，室溫避光孵育1 h。Treg細胞檢測：以1 ml Foxp3 Fix/permeabilization工作液重懸細胞，輕柔震蕩，4℃避光孵育1 h后，每管加2 ml通透緩沖液，300 g/min室溫離心 5 min，棄上清液。加100 μl通透緩沖液重懸細胞后，加入抗Foxp3抗體，4℃避光孵育1 h。上機檢測前，每個樣品加2 ml流式染色緩沖液，400 g/min離心5 min，棄上清液。上述過程重復2次，每管加入流式染色緩沖液1 ml上機。

1.6 踝關節病理檢查 處死小鼠后，于雙側后肢膝關節處截斷，去外皮和肌肉，10%中性甲醛固定48 h，采用硝酸脫鈣2 h，二甲苯浸潤后，石蠟包埋，制成切片，常規HE染色后光學顯微鏡下觀察并拍照。

2 結果

2.1 4組小鼠AI評分的比較 CIA小鼠顯示出明顯的關節腫脹，Gas6干預后，小鼠的關節腫脹明顯減輕，見圖1。在造模后第42天，CIA+生理鹽水組與CIA組相比AI評分差異無統計學意義（P＞0.05），CIA+Gas6組與CIA+生理鹽水組相比AI評分明顯下降（P＜0.01），見表1。

2.2 4組小鼠踝關節病理變化的比較 病理結果發現，對照組小鼠踝關節結構正常，未見顯著的炎癥細胞浸潤和軟骨破壞現象。CIA組小鼠踝關節可見大量炎癥細胞浸潤和嚴重的關節軟骨破壞。與CIA組小鼠相比，CIA+Gas6組小鼠踝關節炎癥細胞減少，關節軟骨破壞減輕，見圖 2（插頁）。

圖2 4組小鼠踝關節病理損傷的比較（a：對照組；b：CIA 組；c：CIA+ 生理鹽水組；d：CIA+Gas6組；HE 染色，×100）

2.3 4組小鼠IL-10、IL-17水平的比較 與對照組相比，CIA小鼠IL-10水平升高（P＜0.05）。與CIA組比較，CIA+Gas6組IL-10水平較高（P＜0.05）。與對照組相比，CIA組小鼠IL-17水平明顯升高（P＜0.01）。與CIA組相比，CIA+Gas6組 IL-17水平明顯下降（P＜0.01），見表2。

2.4 4組小鼠脾臟CD4+IL-17+和CD4+Foxp3+細胞比例的比較 與對照組相比，CIA小鼠脾臟CD4+IL-17+細胞比例明顯升高，而CD4+Foxp3+細胞比例顯著下降（P＜0.01）。與CIA組小鼠相比，CIA+Gas6組小鼠脾臟CD4+IL-17+細胞比例明顯下降（P＜0.05），CD4+Foxp3+細胞比例顯著增加（P＜0.01），見圖3和表3。

圖1 4組小鼠關節圖（a：對照組；b：CIA 組；c：CIA+生理鹽水組；d：CIA+Gas6組）

表1 4組小鼠AI評分的比較（分）

表2 4組小鼠IL-10、IL-17水平的比較（pg/ml）

3 討論

RA總體發病率約為0.3%～1.5%，且晚期致殘率極高，嚴重威脅患者的身心健康[9]。已經證實，RA關節腔和滑膜有包括T淋巴細胞、B淋巴細胞及巨噬細胞等多種免疫細胞浸潤，釋放IL、TNF和IFN等炎癥因子；此外，炎癥因子的釋放可進一步誘導免疫細胞聚集，形成惡性循環，最終引起滑膜和關節損害[1-2]。鑒于此，靶向炎癥和免疫活化一直是RA治療學研究的重點，但迄今為止臨床上仍缺乏有效的干預策略和藥物。

TAM受體是機體重要的“炎癥開關”[5]。有研究證實，TAM受體家族缺失的小鼠，脾臟淋巴細胞大量擴增和活化，可引起機體炎癥性損傷[10]。在肥胖相關的骨關節炎中發現，阻斷TAM受體家族Axl后，關節損傷明顯加重[11]。另據報道，Axl基因缺陷的關節炎小鼠，其滑膜炎癥、骨和軟骨的破壞明顯增加[12]。Gas6是TAM家族的天然配體[5]。本研究發現，Gas6干預后，CIA小鼠AI評分明顯下降，踝關節的病理損害也顯著減輕。上述結果提示，激活Gas6-TAM通路對于減輕RA有著重要的保護作用，但其機制尚不清楚。

CD4+T淋巴細胞是機體獲得性免疫應答的主要細胞。在機體內外環境的影響下，CD4+T淋巴細胞可分化為包括Treg和Th17等多種細胞亞群[3-4]。Th17細胞通過分泌IL-17，激活細胞絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）和核因子 κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）等炎癥信號通路，介導促炎因子的分泌及基質金屬蛋白酶的產生，參與組織炎癥和組織損傷過程[8]。Treg根據其來源不同可以分為天然型和誘導型兩類，Foxp3是其共同的特征和標志分子。Treg是機體免疫耐受得以維持的核心細胞，其可以通過多重機制發揮免疫抑制效應，包括表面抑制分子和分泌免疫抑制性細胞因子IL-10等[6]。Th17/Treg失衡已經被證實是RA 發生和發展的重要因素[3，8]。

圖3 4組小鼠脾臟CD4+IL-17+和CD4+Foxp3+細胞流式圖（A：CD4+IL-17+細胞；B:CD4+Foxp3+細胞；a：對照組；b：CIA 組；c：CIA+生理鹽水組；d：CIA+Gas6組）

表3 4組小鼠脾臟CD4+IL-17+和CD4+Foxp3+細胞比例的比較（%）

與既往研究類似[3，8]，本研究發現CIA小鼠脾臟Treg比例明顯降低，而CD4+IL-17+的比例明顯升高，且外周血IL-17水平也顯著升高。Gas6干預能夠調節Th17/Treg平衡，促進Treg擴增，抑制Th17的產生，提示Gas6對RA的治療作用可能與其對Treg/Th17平衡調控有關。本研究發現RA小鼠的外周血IL-10水平也明顯增加，Gas6干預后IL-10水平進一步增加。在炎癥狀態下，包括Treg、Th2細胞以及單核細胞等均可代償性分泌IL-10。IL-10一方面可抑制炎癥反應，另一方面能通過刺激B細胞成熟，阻斷其凋亡而發揮潛在的致炎作用。鑒于IL-10已被證實能夠改善RA小鼠的關節損傷[13]，IL-10可能是介導Gas6抗炎作用的另一重要機制。

綜上所述，Th17/Treg失衡參與了RA的致病過程。Gas6能夠促進Treg擴增，抑制Th17細胞分化，起到減輕RA關節損害的作用。然而，Gas6調控Th17/Treg平衡的機制尚不清楚，有待進一步研究。