補腎法通過抑制內質網應激提高子宮內膜容受性研究*

河北中醫學院 河北省中西醫結合肝腎病證研究重點實驗室

何 蓮 杜澍金 曹 璨 范麗潔 賀 明 陳景偉 張 宇(石家莊 050200)

提要 目的：研究補腎法(補腎調經方)對控制性超促排卵(COH)小鼠圍著床期內質網應激的影響，探討其提高子宮內膜容受性的作用機制。方法：實驗小鼠建立COH模型并給予補腎干預，觀察小鼠妊娠數和胚胎種植數，于孕4 d取子宮，Western blot和實時定量PCR分析子宮組織中雌激素受體(ERα)和內質網應激相關蛋白葡萄糖調節蛋白78(GRP78)的表達變化；組織免疫熒光觀察ERα和GRP78在子宮內膜的分布。結果：模型組小鼠妊娠數、胚胎種植數顯著低于正常組(P<0.05)；模型組小鼠ERα和GRP78在子宮內膜基質細胞、微血管內皮細胞中表達，且ERα的表達水平顯著降低(P<0.05)，GRP78的表達水平顯著增高(P<0.05)。與模型組相比，給予補腎調經方干預后，小鼠妊娠數、胚胎種植數明顯增高(P<0.05)；ERα的mRNA和蛋白水平明顯增高(P<0.05)，GRP78的mRNA和蛋白水平顯著降低(P<0.05)。結論：補腎法(補腎調經方)改善COH小鼠子宮內膜容受性，與促進ERα表達抑制子宮內膜內質網應激有關。

體外授精(IVF)是目前治療不孕癥的主要手段，但每次胚胎移植的妊娠率仍然較低，僅占20%～30%。究其原因，1/3是卵母細胞質量及胚胎內在缺陷，2/3在于子宮內膜容受性不良。故提高子宮內膜容受性已成為胚胎成功著床的關鍵因素[1-2]。

研究發現，補腎法中的補腎調經方具有增加子宮內膜厚度、提高子宮內膜容受性的作用[3-4]。建立控制性超促排卵(COH)模型并給予補腎干預，觀察補腎調經方對子宮雌激素受體(ERα)和葡萄糖調節蛋白78(GRP78)表達的影響，探討補腎法改善內質網應激，提高子宮內膜容受性的可能機制。這對于揭示中醫“腎主生殖”的理論內涵，探索中醫調經種子的作用機制意義重大。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 8～10周齡雌性昆明系小鼠60只，健康未孕，清潔級，體質量為25～30 g；雄性昆明系成年小鼠30只，體質量為30～35 g。購自河北省實驗動物中心。飼養于清潔級環境中，環境溫度23℃～25℃，自由進食進水。

1.2 主要藥物 補腎調經方組成：山茱萸15 g，山藥12 g，熟地黃20 g，枸杞子12 g，紫河車10 g，菟絲子12 g，淫羊藿10 g，女貞子9 g，覆盆子、當歸各10 g，香附6 g，白芍9 g，丹參10 g等。均購自河北中醫學院國醫堂藥房，制成1.5 g生藥/mL精致混懸液。

1.3 主要試劑 尿促性腺激素(HMG)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)(麗珠醫藥集團股份有限公司)，促性腺激素釋放激素類似物(GnRHa)(YZ-140667-20 mg, 北京索萊寶科技有限公司)。ERα抗體(sc-71064, Santa Cruz)；GAPDH抗體(10494-1-AP, Proteintech)；GRP78抗體(ab108615, Abcam)；HRP鼠二抗(sc-516102, Santa Cruz)；熒光二抗(SA0008-2, Proteintech)；Total RNA Kit Ⅱ(R6934-01, OMEGA)；M-MLV (H-) Reverse Transcriptase(R021-01, Vazyme)；SYBR qPCR Master Mix(Q311-02, Vazyme)。

2 實驗方法

2.1 動物模型建立 按照參考文獻[5]復制COH模型。將60只成年雌性小鼠行陰道脫落細胞學檢查2個動情周期，于動情后期開始對周期規律者用藥。每日9:00腹腔注射GnRHa(40 IU/100 g)，連續9 d，1次/d；第9 d同時注射HMG(400 IU/kg)，第11 d 9:00注射hCG(100 IU/100 g)，COH造模完成。

2.2 實驗動物分組與用藥 將60只8～10周齡雌性昆明系小鼠分為正常組、模型組、補腎組3組,每組20只。補腎組造模同時灌胃補腎調經方0.4 mL，1次/d；正常組每日腹腔注射/灌胃等量蒸餾水；第11 d(D11)(注射hCG日)16:00，將各組小鼠按雌∶雄=2∶1合籠，次日早晨發現陰栓者記為妊娠第1 d(D1)。

2.2 標本采集與處理 于妊娠第4 d(D4)取子宮，生理鹽水沖洗干凈，截取一部分用4%多聚甲醛固定(用于組織免疫熒光)，另一部分立即置于液氮內，然后轉入-80℃冰箱保存(用于Western blot和實時熒光定量PCR)。各組剩余小鼠于妊娠第8 d(D8)計數胚胎種植數。

2.3 檢測

2.3.1 組織免疫熒光染色：取小鼠子宮組織的石蠟切片，經烤片、脫蠟、水化、抗原修復后，10%山羊血清室溫孵育30 min，4℃過夜封閉一抗：ERα抗體(1∶50稀釋)、GRP78抗體(1∶50稀釋)。第2 d，PBS洗片，熒光二抗孵育1 h，DAPI孵育10 min，封片。最后利用Leica公司SP8激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

2.3.2 實時定量PCR：取子宮組織剪碎，加入TRIZOL試劑組織勻漿管勻漿，提取總RNA。利用試劑盒將總RNA逆轉錄成cDNA后，按SYBR qPCR Master Mix使用說明書進行PCR。采用2-ΔΔCt法計算目的mRNA的相對表達量。所用引物序列如表1。

表1 所用引物序列

2.3.3 Western blot分析：提取子宮組織蛋白液，與5×上樣緩沖液混勻，變性處理后進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。轉膜，并用5%牛奶37℃封閉2 h。TTBS洗膜后，一抗(Anti-ERα和Anti-GRP78均1∶500稀釋)孵育，4℃過夜。第2 d洗膜后，二抗(1∶20 000稀釋)室溫孵育2 h，洗膜。利用化學發光成像分析系統(LAS 4000，美國GE公司)曝光顯影，檢測抗體特異性結合條帶。

3 結果

3.1 各組小鼠妊娠率及胚胎種植數 與正常組相比，模型組妊娠率和胚胎種植數均明顯降低(P<0.05)；與COH模型組相比，補腎組妊娠率和胚胎種植率均明顯增高(P<0.05)，但與正常組差異無顯著性(P>0.05)。詳見表2。

3.2 各組小鼠圍著床期子宮內膜ERα及GRP78蛋白變化 ERα在子宮內膜腔上皮、腺上皮細胞、基質細胞及微血管中均有表達。與正常組相比，模型組子宮內膜ERα的表達明顯降低，而GRP78明顯增高。補腎組子宮內膜ERα的表達明顯增高，而GRP78明顯降低，與正常組差異無顯著性(P>0.05)。見圖1。

表2 各組小鼠的妊娠數和胚胎種植數比較

注：M 模型組；BS 補腎組；Merge(ERα與DAPI、GRP78與DAPI的組合)。

3.3 各組小鼠圍著床期子宮內膜ERα及GRP78 mRNA的表達 模型組中ERα mRNA表達明顯降低(P<0.05)，GRP78 mRNA表達明顯升高(P<0.05)。而補腎組中ERα表達明顯高于模型組(P<0.05)，GRP78表達明顯低于模型組(P<0.05)，ERα和GRP78表達與正常組差異無顯著性(P>0.05)。見圖2。

3.4 各組小鼠種植窗期子宮內膜ERα及GRP78蛋白的表達 檢測各組小鼠子宮內膜中蛋白表達水平，模型組ERα明顯降低(P<0.05)，GRP78明顯增高(P<0.05)。而補腎組中ERα明顯高于模型組(P<0.05)，GRP78明顯低于模型組(P<0.05)，ERα和GRP78蛋白表達與正常組差異無顯著性(P>0.05)。見圖3。

注：與正常組(Con)相比，*P<0.05；與模型組(M)相比，#P<0.05。

注：A. Western blot條帶結果。B. 相對灰度值。與正常組(Con)相比，*P<0.05；與模型組(M)相比，#P<0.05。

4 討論

IVF-ET輔助生殖技術日益成熟，在生殖醫學領域發揮著重要作用。控制性超促排卵是IVF-ET過程中的重要環節，盡管可以通過控制性超促排卵獲取多個卵子，但是胚胎種植的妊娠率仍較低。胚胎的成功植入需要高質量的胚胎、容受性好的子宮以及胚胎和內膜之間一系列的緊密調節作用。其中，如何改善子宮內膜容受性一直是生殖醫學研究人員關注的重點問題。

中醫認為，腎藏精，主生殖。《素問·六節藏象論》曰：“腎者，主蟄，封藏之本，精之處也。”[6]胎元進入胞宮之后，腎即行使其封藏功能，腎精充盈，氣血充足則子宮內膜有所養而表現出最大容受能力，與現代醫學所說的胚胎著床以及子宮內膜容受性不謀而合。中醫認為，腎精充足、腎氣旺盛子宮內膜得以生長。反之，若腎氣虛弱、腎精不足則男女之精無以植入胞宮。因此，腎虛是子宮內膜容受不良的主要病機。臨床上補腎法/補腎活血法是治療不孕癥的常用方法，且療效肯定。補腎中藥可以增加子宮內膜厚度，改善子宮內膜形態，增加子宮血流，進而改善子宮內膜容受性，提高臨床妊娠率[7-8]。對于腎氣陰虛的患者，連方等[9]臨床研究發現復方二至天癸顆粒可以減少子宮內膜局部T淋巴細胞數量，從而提高妊娠率。腎虛，運化無力可致瘀血內阻于胞宮，從而引起不孕。補腎活血法可以促進子宮內膜標志物HOXA10、HOXA11、血管內皮生長因子VEGF的表達、MVD和LIF表達，證實該法可以改善子宮內環境，從而提高妊娠率[10-12]。本研究建立COH小鼠模型，并在模型建立過程中每日對小鼠灌胃補腎調經方0.4 mL(等效于臨床劑量)進行干預，證實了COH明顯降低了小鼠的妊娠率和胚胎種植數，而中藥補腎調經方可以顯著提升COH小鼠的妊娠率和胚胎種植數，其治療結果與正常小鼠差異無顯著性。

內質網是細胞內的一個精細的膜系統，參與分泌蛋白和跨膜蛋白的合成、折疊、成熟和翻譯后修飾等[13]。研究發現，內質網應激與肌體的多種疾病發生發展相關，如心血管疾病和神經系統疾病等，其機制均與內質網應激誘導細胞凋亡有關[14]。當一些應激刺激(如缺氧、氧化應激、營養缺乏、鈣穩態失衡等)干擾了內質網功能時，未折疊或錯誤折疊蛋白在內質網積聚，發生內質網應激(ERS)[15-16]。內質網應激時，不能正確折疊的蛋白質積聚在內質網腔內，內質網應激過強或持續時間過久，可導致不可逆轉的細胞凋亡[17-18]。筆者推測，由于氧化應激、缺氧、營養缺乏、鈣穩態失衡等微環境異常誘發子宮內膜細胞發生內質網應激，進而導致子宮內膜凋亡，血供減少，形態上表現為子宮內膜薄、功能上表現為子宮內膜功能不完全，致使子宮內膜容受性低，胚胎著床率低。研究發現補腎調經方可以抑制內質網應激相關蛋白GRP78表達，表明補腎調經方可以改善子宮微環境異常時所導致的子宮內膜的內質網應激，減少子宮內膜凋亡、血供減少等子宮內膜功能不良情況的出現。

ERα是屬于甾體激素受體家族的重要成員，廣泛存在于內皮細胞、毛細血管外膜細胞和子宮內膜基質細胞等[19]，COH過程中，ERα提前下降，基質細胞和腺細胞不同步發育，基質細胞提前蛻膜化，子宮內膜容受性下降[20-21]。筆者研究發現，補腎調經方可以促進COH小鼠中ERα表達，因此推測補腎調經方可能通過提高ERα水平，進而調節GRP78的表達，以達到改善子宮內膜厚度及血供、維護子宮內膜功能完整性的目的。其具體機制及相關信號通路，還尚待進一步研究。